白菊濕疹膏安全性實驗研究

史向華，續 艷，牛 丹，薛潤苗，楊文彬，柴秋彥，張俊榮

（1.山西省醫藥與生命科學研究院，山西太原030006； 2.山西中醫藥大學，山西晉中030619）

濕疹是由多種內外因素引起的瘙癢劇烈的一種過敏性皮膚炎癥反應，是一種遲發型變態反應。臨床上以紅斑、丘疹、丘皰疹為主，病程不規則，呈反復發作，難根治，對患者正常工作和生活造成巨大影響。目前常用的西藥主要有糖皮質激素類、抗組胺類、類激素類藥物等，盡管可以快速緩解癥狀，但長期使用，副作用較大。白菊濕疹膏是在臨床驗方的基礎上研制而成的中藥制劑，療效確切。本研究主要評價白菊濕疹膏對家兔及豚鼠皮膚的致敏作用，以及小鼠灌胃給藥和皮膚給藥的安全性，并為臨床研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑 白菊濕疹膏（主要由白菊、苦參和黃連等中藥組成），中國人民武裝警察部隊藥品儀器檢定所提供（樣品為淡棕褐色軟膏，純度：99.1%，置冰箱中備用）。復方醋酸地塞米松乳膏（999皮炎平）30 g，深圳三九醫藥股份有限公司，批號：H44024170。二甲苯：衡陽有機試劑廠生產，批號：20100327。2，4-二硝基氯苯（DNCB）：中國醫藥公司北京分公司，批號：20101026。

1.1.2 實驗動物 SPF昆明種（KM）小鼠，112只，體質量（20-25）g，雌雄各半，由山西醫科大學動物實驗中心提供，合格證號：SYXK（晉）2017-0001。豚鼠，16 只，體質量（350±10）g，雌雄各半，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，合格證號SCXK（京）2011-0010。新西蘭白兔，24只，雌雄各半，體質量（2-2.5）kg，北京科宇動物養殖中心提供，合格證號SCXK（京）2007-003。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒性實驗

1.2.1.1 預實驗 方法參照文獻。找出引起小鼠100%和0死亡的劑量。取12只小鼠，體質量（20～25）g，隨機分為3組，每組4只，雌雄各2只，分別按體質量40 mL/kg、20 mL/kg、10 mL/kg的劑量經口給藥，給藥前12 h禁食、不禁水，給藥后常規飼養，并觀察小鼠 3 d 內死亡情況［1-2］。

1.2.1.2 最大給藥量實驗 方法參照文獻。取小鼠 60 只，體質量（20～25）g，隨機分為 3 組：對照組、空白基質組（凡士林40 mL/kg）和白菊濕疹膏組（40 mL/kg），每組20只，雌雄各10只。按上述劑量1次灌胃給藥，對照組給予同體積蒸餾水。各組小鼠給藥前禁食12 h，不禁水，給藥后常規飼養。連續觀察7 d內小鼠的中毒反應及死亡情況，如無死亡，則此用藥量即為小鼠的最大給藥量［2］。計算灌胃給藥組小鼠的最大給藥量為擬臨床用藥劑量的倍數。

1.2.1.3 皮膚給藥對小鼠的急性毒性實驗 方法參照文獻。取KM 種小鼠40只，體質量（18～22）g，隨機分為兩組，即基質對照組、白菊濕疹膏組，每組20只；實驗前小鼠背部正中剪毛后，以8%硫化鈉溶液脫毛，面積約2.5 cm×4 cm，24 h后用于實驗［3-4］。實驗當日，在小鼠背部脫毛區分別涂抹基質和白菊濕疹膏，給藥量為25 g/kg，給藥后連續觀察7 d，記錄動物死亡數及毒性反應。

1.2.2 家兔皮膚刺激性實驗 方法參照文獻［2］。新西蘭白兔 16 只，體質量（2～2.5）kg，雌雄各半，采用自身對照，設單次給藥完整皮膚組、單次給藥破損皮膚組、多次給藥完整皮膚組和多次給藥破損皮膚組，分別進行單次和多次給藥皮膚刺激性實驗。于實驗前1 d，將每只家兔背部脊柱兩側去毛（每側約3 cm×3 cm，無紅斑、水腫及破損），再用8%Na2S水溶液脫毛。全部受試家兔去毛后，單籠飼養每只家兔。破損皮膚組的制作：先將針頭用75%酒精消毒，然后在每只家兔背部兩側去毛區皮膚處劃“#”字以滲血為度。單次給藥完整皮膚組、單次給藥破損皮膚組，以脊柱為分割線分為左右兩側受試區，每側受試區又分為兩部給藥區（左一為白菊濕疹膏0.2 g/3×3 cm組，左二為白菊濕疹膏0.4 g/3×3 cm組，右一為空白對照組，右二為基質0.4 g/3×3 cm組），涂抹用藥后，用一層5 cm×5 cm保鮮膜覆蓋保濕，再加無菌紗布覆蓋，最后用醫用膠布和繃帶適當固定。涂抹后6 h，用溫水洗去殘留受試藥，觀察受試部位1，24，48，72 h有無紅斑及水腫。

多次給藥完整皮膚組和多次給藥破損皮膚組分組及給藥方法同上，每天1次，連續7 d。每次涂抹后6 h，洗去殘留涂抹物，在洗去涂抹物后1 h及再次給藥前觀察紅斑、水腫等，并對紅斑、水腫進行評分。末次用藥后去除受試物，觀察涂抹部位1，24，48，72 h有無紅斑和水腫等情況以及上述變化的恢復。多次皮膚刺激實驗中每天每只動物平均積分=（紅斑形成總分+水腫形成總分）／（合計動物數×7）。所有動物均用數碼相機拍照，根據上述公式計算平均積分值，按照皮膚刺激反應評分標準及皮膚刺激強度評價標準［5-6］，對刺激強度進行評分。

1.2.3 豚鼠皮膚過敏實驗 方法參照文獻［7］。24只豚鼠，體質量（350±10）g，按體質量、性別隨機分成4組，分別為空白對照組、白菊濕疹膏組（用藥組）、基質組及陽性對照組（0.1%2，4-二硝基氯代苯）。于實驗前1 d，采用8%Na2S水溶液對受試豚鼠背部脊柱兩側去毛（每側約3 cm×3 cm，無紅斑、水腫及破損）。將白菊濕疹膏0.2 g、基質0.2 g、1%的2，4-二硝基氯代苯0.2 mL（臨用時用丙酮配制，致敏濃度）分別涂于各組動物的左側脫毛區（空白對照組不做處置），固定6 h后擦去殘留受試藥，第7天和14天以同樣方法重復，此為接觸致敏。

于末次涂藥后14 d進行激發致敏，各組動物分別在右側脫毛區涂生理鹽水白菊濕疹膏0.2 g，基質0.2 g，陽性對照組涂以2，4-二硝基氯代苯（0.1%）0.2 mL（臨用時用丙酮配制）。6 h后去除涂抹物，立即觀察，并于24，48，72 h重復觀察涂抹部位有無紅斑和水腫等過敏反應癥狀。參照文獻［5-6］，按照皮膚過敏性反應評分標準及皮膚過敏性反應評價標準進行過敏反應評分。過敏反應平均積分=（紅斑形成總分+水腫形成總分）／合計動物數；致敏率（%）=出現皮膚紅斑和水腫的動物數／受試動物總數×100%。

2 結 果

2.1 急性毒性實驗

2.1.1 預實驗 結果顯示，12只小鼠均無死亡，無法測出其半數致死量（LD50），采用最大給藥量來評價受試藥物對小鼠的急性毒性作用。

2.1.2 最大給藥量實驗 結果顯示，空白基質組、白菊濕疹膏組和對照組，按上述劑量灌胃給藥后30 min內，部分小鼠活動偶有減少，至1 h后完全恢復。給藥期間，小鼠整體體重平穩增長，飲食、皮膚與毛發、行為、活動、分泌物、排泄物等均未見明顯異常，14 d內動物均無中毒反應及死亡。實驗結束后，處死全部動物，解剖，肉眼觀察，各鼠組織器官未見明顯異常。表明白菊濕疹膏灌胃給藥小鼠無明顯急性毒性，其對小鼠灌胃的最大給藥量為40 mL/kg或40 g/kg。參照文獻計算灌胃給藥組小鼠的最大給藥量為擬臨床用藥劑量的1600倍［5］。

2.1.3 皮膚給藥對小鼠的急性毒性實驗 結果顯示，白菊濕疹膏皮膚給藥60 min內，部分小鼠活動偶有減少，出現感覺不適癥狀（舔、用后肢撓背部涂藥處），2 h后完全恢復。實驗觀察期間小鼠飲食、行為、活動等均未見明顯異常，口、鼻、耳、眼無異常分泌物，排泄物（大小便）等均正常。用藥處皮膚未見有紅腫、滲出及潰爛等異常改變。實驗7 d時，脫毛處皮膚毛發已經全部長出，皮膚光滑平整，給藥組同基質組比較無明顯差異，實驗期間無動物死亡。實驗結束后，處死全部動物，解剖、觀察各鼠組織器官未見明顯異常。

2.2 家兔皮膚刺激性實驗

結果顯示，對家兔破損皮膚和完整皮膚單次或多次涂抹白菊濕疹膏或基質后6 h、24 h、48 h、72 h的刺激反應評分均為0分。

2.3 豚鼠皮膚過敏實驗

結果見表1。在整個觀察過程中，白菊濕疹膏組和基質組未見受試區出現紅斑及水腫，陽性對照組自激發給藥6 h后受試區出現輕度紅斑，無水腫，致敏率100%。白菊濕疹膏對豚鼠致敏率為0，反應平均值為0，表明無致敏性，而2，4-二硝基氯化苯致敏率為100%，為極度致敏性。

表1 對豚鼠皮膚過敏實驗的影響

3 討論

本次實驗結果表明，KM小鼠口服給藥白菊濕疹膏組不能求得LD50，其最大給藥量為40.00 mL/kg，此劑量約為（兒童按20 kg體質量計算）臨床擬用劑量（0.025 mL/kg）的1600倍。皮膚給藥白菊濕疹膏組不能求得LD50，其最大給藥量為25.00 g/kg，此劑量約為（兒童按20 kg體質量計算）臨床擬用劑量（0.025 g/kg）的1000倍。白菊濕疹膏在本實驗條件下，對家兔破損和完整皮膚、單次或多次涂抹白菊濕疹膏，刺激反應評分均為0分，表明白菊濕疹膏對家兔破損皮膚和完整皮膚、單次或多次涂抹均無刺激性。白菊濕疹膏對豚鼠致敏率為0，反應平均值均為0，顯示無致敏性，而2.4-二硝基氯化苯致敏率為100%，為極度致敏性［4］。

急性毒性實驗、皮膚刺激性實驗、皮膚致敏實驗是新藥臨床前安全性評價的重要組成部分，在本實驗所用劑量范圍內，白菊濕疹膏對皮膚無毒性、無刺激性、無致敏性，表明其使用安全，無毒副作用。綜上所述，白菊濕疹膏經皮膚給藥安全性好。