甘草附子湯對(duì)小鼠疼痛模型及寒濕證疼痛模型止痛作用比較研究

靳 荃，青千裕，郜憲明，趙子葦，趙 樂(lè)，李艷彥，王永輝，孫力威

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619； 2.香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，香港999077）

甘草附子湯出自《傷寒雜病論》117條，“風(fēng)濕相搏，骨節(jié)疼煩，掣痛不得屈伸，近之則痛劇，汗出短氣，小便不利，惡風(fēng)不欲去衣，或身微腫者，甘草附子湯主之”。該方由炙甘草、炮附子、白術(shù)、桂枝四味藥組方而成，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、溫陽(yáng)補(bǔ)中的功效。小鼠熱板法與小鼠扭體法是經(jīng)典的藥理學(xué)疼痛模型，可從不同角度證明藥物的止痛作用。關(guān)于中藥及藥物有效成分止痛實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)報(bào)道較多［1-2］，但極少有文獻(xiàn)報(bào)道方劑對(duì)中醫(yī)病證結(jié)合模型止痛實(shí)驗(yàn)方面的研究［3］。本研究擬通過(guò)研究甘草附子湯對(duì)小鼠經(jīng)典疼痛模型與寒濕證疼痛模型的止痛作用，探究方劑與中醫(yī)證候模型之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與動(dòng)物 塞來(lái)昔布（輝瑞制藥有限公司，J20140072）；醋酸溶液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，20150607）。SPF 級(jí) CD-1（ICR）小鼠 140只，雌性，6～8 周齡，體質(zhì)量（28±5）g，SCXK（京）2016-0006，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。溫度（19±2）℃，濕度40%～60%，飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間充足攝食、攝水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 DHP-9082B型恒溫箱（上海一恒公司），RB-200智能熱板儀（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熱板實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 中藥復(fù)方制備 甘草附子湯組成按《金匱要略》原方劑量換算（1兩=3 g），煎煮2次，合并濾液，并濃縮至含生藥劑量5 g/kg，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 熱板實(shí)驗(yàn)前小鼠篩選 雌性小鼠80只，放入溫度已控制好的熱板儀上（55±0.5）℃，立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，并蓋上有機(jī)玻璃罩避免小鼠躍出，仔細(xì)觀察，待小鼠舔后足時(shí)馬上停止計(jì)時(shí)。開(kāi)始舔腳時(shí)間在10～30 s之間為正常痛閾值，其他時(shí)間段均剔除，小鼠有跳躍的情況也剔除。篩選痛閾值合格的小鼠60只，間隔5 min后，再次測(cè)定痛閾值，以2次平均值作為小鼠給藥前的正常痛閾值。

1.2.1.3 分組與給藥 將符合條件的小鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，對(duì)照組、甘草附子湯組、塞來(lái)昔布組、寒濕證模型組、寒濕證甘草附子湯組、寒濕證塞來(lái)昔布組，每組10只。小鼠寒濕證模型的建立：除對(duì)照組、甘草附子湯組、塞來(lái)昔布組外，其余各組小鼠每日上午9點(diǎn)開(kāi)始于水溫（14.0±0.5）℃水中游泳至力竭下沉?xí)r撈出，下午2點(diǎn)將小鼠置于人工氣候箱［溫度：（4±0.5）℃，濕度：90%～95%）］中 4 h［4-5］，連續(xù)刺激 15 d。除對(duì)照組及寒濕證模型組灌胃生理鹽水外，其余組灌胃相應(yīng)藥物：甘草附子湯劑量為10.92 g/kg，塞來(lái)昔布膠囊以蒸餾水溶解，濃度為30.04 mg/kg，灌胃容積為0.15 mL/10 g，每天1次，連續(xù)15 d。

1.2.1.4 觀察指標(biāo) 灌胃結(jié)束后，在安靜的環(huán)境中，分別測(cè)定各組小鼠灌胃后45 min、90 min、135 min、180 min時(shí)小鼠的痛閾值。將各組小鼠放入溫度已控制好的熱板上（55±0.5）℃，立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，并蓋上有機(jī)玻璃罩避免小鼠躍出，仔細(xì)觀察，記錄各組小鼠開(kāi)始舔腳時(shí)間，待小鼠舔后足時(shí)馬上停止計(jì)時(shí)。若小鼠放入熱板儀中60 s仍無(wú)反應(yīng)，痛閾值按60 s計(jì)。

1.2.2 扭體實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 分組與給藥 方法同1.2.1.1。小鼠寒濕證模型的建立同1.2.1.3。

1.2.2.2 觀察指標(biāo) 各組小鼠末次灌胃30 min后，腹腔注射0.6%冰乙酸（0.1 mL/10 g），立即將小鼠單只放入籠內(nèi)，觀察15 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的潛伏期（注射冰乙酸后至第一次扭體反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間）和扭體次數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用重復(fù)測(cè)量方差分析法，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析法（ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況

對(duì)照組小鼠口唇紅潤(rùn)，毛發(fā)光澤，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，體重逐漸增高。寒濕證小鼠造模期間，逐漸出現(xiàn)大便變稀，體重升高變慢，毛發(fā)顏色變暗。造模15 d后小鼠毛發(fā)不澤，甚至稀疏粗糙，小鼠狀態(tài)萎靡，嗜睡，對(duì)外界刺激反應(yīng)較慢，飲食減少，體重增加較慢，足趾及尾巴顏色變淺甚至出現(xiàn)瘀斑，大便稀。給藥后寒濕證塞來(lái)昔布組小鼠毛色逐漸恢復(fù)光澤，足趾顏色淺灰，瘀斑減輕，仍大便偏稀，皮膚青灰。給藥后寒濕證甘草附子湯組毛發(fā)開(kāi)始有光澤，足趾顏色恢復(fù)正常，在籠內(nèi)活動(dòng)增多，飲食量變大，大便在給藥后第5天即由稀溏變?yōu)檎！?/p>

2.2 熱板實(shí)驗(yàn)

2.2.1 甘草附子湯對(duì)小鼠疼痛出現(xiàn)時(shí)間的影響 與對(duì)照組比較，在給藥后90 min塞來(lái)昔布組舔腳時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05）；與寒濕證模型組比較，在給藥后135 min寒濕證甘草附子湯組舔腳時(shí)間變長(zhǎng)（P＜0.01）。與甘草附子湯組比較，在給藥后180 min，寒濕證甘草附子湯組、寒濕證塞來(lái)昔布組舔腳時(shí)間變長(zhǎng)（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表 1。

2.2.2 尾巴情況 造模第7天，寒濕證模型組及寒濕證塞來(lái)昔布組、寒濕證甘草附子湯組小鼠尾巴皮膚均變暗，顏色發(fā)青。造模第15天，以上各組小鼠尾尖顏色變青，甚至出現(xiàn)尾尖壞死情況。給藥后寒濕證塞來(lái)昔布組小鼠尾巴顏色未恢復(fù)正常。寒濕證甘草附子湯組小鼠給藥10 d后尾巴顏色即恢復(fù)正常。

2.2.3 關(guān)節(jié)、皮膚變化 造模第7天，寒濕證模型組及寒濕證塞來(lái)昔布組、寒濕證甘草附子湯組部分小鼠出現(xiàn)足背顏色變深，有水腫出現(xiàn)；造模第15天，更多小鼠出現(xiàn)足背水腫情況，甚至部分小鼠出現(xiàn)趾端壞死情況。給藥15 d后，寒濕證塞來(lái)昔布組小鼠足背水腫程度變輕，顏色稍顯青黑；寒濕證甘草附子湯組足背水腫消失，顏色恢復(fù)紅潤(rùn)。

2.2.4 大便情況 對(duì)照組小鼠糞便呈顆粒狀，中等硬度。在造模第5天，寒濕證模型組、寒濕證塞來(lái)昔布組和寒濕證甘草附子湯組部分小鼠出現(xiàn)糞便不成形或稀溏；給藥15 d后，寒濕證甘草附子湯組大便逐漸變硬，寒濕證塞來(lái)昔布組小鼠大便普遍偏稀，僅有少部分大便成形。

表1 甘草附子湯對(duì)小鼠疼痛出現(xiàn)時(shí)間的影響 （s，±s）

表1 甘草附子湯對(duì)小鼠疼痛出現(xiàn)時(shí)間的影響 （s，±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與寒濕證模型組比較，2）P＜0.05；與甘草附子湯組比較，3）P＜0.05

組別 n對(duì)照組 10甘草附子湯組 10塞來(lái)昔布組 10寒濕證模型組 10寒濕證甘草附子湯組 10寒濕證塞來(lái)昔布組 10開(kāi)始舔腳時(shí)間給藥后45 min 給藥后90 min 給藥后135 min 給藥后180 min 12.12±3.24 13.29±4.72 12.63±3.49 17.88±5.68 13.49±5.08 16.07±7.55 18.80±7.43 14.57±4.26 15.14±3.95 18.75±2.991） 19.70±4.54 23.28±7.76 12.19±3.53 14.93±4.08 15.57±3.53 17.08±5.21 14.81±3.60 16.73±2.56 22.52±8.482） 21.93±3.743）14.14±8.24 15.07±5.61 18.20±6.68 22.21±5.533）

2.3 甘草附子湯對(duì)寒濕證疼痛模型小鼠扭體實(shí)驗(yàn)的影響

與對(duì)照組比較，塞來(lái)昔布組扭體次數(shù)減少（P＜0.05），扭體潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.01）；與寒濕證模型組比較，寒濕證塞來(lái)昔布組小鼠扭體次數(shù)減少、潛伏時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05），寒濕證甘草附子湯組扭體次數(shù)減少（P＜0.01）。與甘草附子湯組比較，寒濕證甘草附子湯組扭體次數(shù)減少、潛伏時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 甘草附子湯對(duì)寒濕證疼痛模型小鼠扭體實(shí)驗(yàn)的影響 （±s）

表2 甘草附子湯對(duì)寒濕證疼痛模型小鼠扭體實(shí)驗(yàn)的影響 （±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與寒濕證模型組比較，3）P＜0.05；與甘草附子湯組比較，4）P＜0.05

組別 n對(duì)照組 10甘草附子湯 10塞來(lái)昔布組 10寒濕證模型組 10寒濕證甘草附子湯組 10寒濕證塞來(lái)昔布組 10扭體次數(shù)（次） 潛伏時(shí)間（s）37.20±3.97 14.34±1.22 32.70±6.54 14.02±2.07 29.70±7.661） 15.22±1.142）36.70 ±6.06 14.18±0.97 28.50 ±4.654） 16.20±1.624）32.10 ±4.253） 15.39±0.703）

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與寒濕證模型組比較，寒濕證甘草附子湯組扭體次數(shù)減少（P＜0.01），且在給藥后 135 min舔腳時(shí)間變長(zhǎng)（P＜0.01）；與甘草附子湯組比較，寒濕證甘草附子湯組扭體次數(shù)減少、潛伏時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05），且在給藥后 180 min舔腳時(shí)間變長(zhǎng)（P＜0.05）。由此可以得出，甘草附子湯對(duì)寒濕證疼痛模型的止痛作用更加顯著。

甘草附子湯由炙甘草、炮附子、白術(shù)、桂枝四味藥組成。方中炙甘草味甘性溫，既可補(bǔ)中益氣，又可緩急止痛；附子味辛甘性大熱，可溫陽(yáng)散寒定痛；白術(shù)味甘性溫，益氣健脾，性燥又可祛除濕邪；桂枝味辛甘性溫，有祛風(fēng)散寒、溫通經(jīng)絡(luò)之功。諸藥相伍，寒邪得散，濕滯得除，經(jīng)絡(luò)得通，疼痛可止。故本方對(duì)寒濕證疼痛有良好的治療作用。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明，甘草對(duì)拘急疼痛小鼠有抑制作用［6］；不同方法炮制的附子對(duì)熱板法及扭體法小鼠均具有一定鎮(zhèn)痛作用［7］；甘草附子湯中黑順片配伍甘草能夠抑制炎性細(xì)胞的分泌，有一定的鎮(zhèn)痛作用［5］；白術(shù)具有一定的鎮(zhèn)咳、祛痰及鎮(zhèn)痛作用［8］；桂枝對(duì)小鼠扭體反應(yīng)具有一定的抑制作用［9］。甘草附子湯中的四味藥，均有止痛作用，對(duì)于熱板實(shí)驗(yàn)和扭體實(shí)驗(yàn)所引起的疼痛都有不同程度的抑制作用。甘草附子湯的主要藥理成分為烏頭堿、甘草苷、甘草異素等，甘草苷可降低烏頭堿的毒性，加強(qiáng)烏頭堿的止痛作用；甘草異素可緩解平滑肌痙攣［10］。白術(shù)、甘草和桂枝與附子同煮，可促進(jìn)附子中的生物堿溶出［11］。可見(jiàn)甘草附子湯主要由烏頭堿和甘草異素發(fā)揮作用，達(dá)到止痛的作用。臨床研究表明，甘草附子湯能夠迅速改善寒濕痹阻型急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀，可有效降低C反應(yīng)蛋白水平，具有良好的鎮(zhèn)痛作用［13］。

小鼠熱板法是由于溫度刺激小鼠足爪引起小鼠疼痛中樞興奮產(chǎn)生痛覺(jué)，小鼠通過(guò)舔腳以減輕疼痛。經(jīng)過(guò)寒濕環(huán)境的持續(xù)刺激，寒濕證模型小鼠在造模成功后，寒濕之氣凝結(jié)體內(nèi)，對(duì)熱的刺激更加耐受，尤其是在給藥90 min之后，寒濕證模型各組舔腳時(shí)間均變長(zhǎng)。甘草附子湯有溫陽(yáng)散寒之功，且甘草附子湯藥物都有一定的止痛作用，故寒濕證小鼠灌胃甘草附子湯后止痛作用更為明顯。小鼠扭體法是由于小鼠腹腔注射冰醋酸刺激腹腔內(nèi)組織引發(fā)腹腔炎癥反應(yīng)，與外周神經(jīng)相關(guān)，小鼠腹腔內(nèi)組織受刺激后自發(fā)通過(guò)扭動(dòng)身體以減輕疼痛刺激。甘草附子湯作用于寒濕證模型疼痛小鼠在散寒祛濕的同時(shí)又通絡(luò)止痛，可減輕小鼠腹腔內(nèi)刺激而減輕疼痛。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為疾病的發(fā)生是由于人體氣血陰陽(yáng)失衡，從而表現(xiàn)出一類(lèi)癥狀，這一類(lèi)癥狀可以歸納為一個(gè)或多個(gè)證候，選擇與證候相應(yīng)的方劑或藥物治療疾病，就是“方證相應(yīng)”［13-14］。張仲景在《傷寒論》中言“觀其脈癥，知犯何逆，隨證治之”，就是要把握疾病之后隱藏的證候。方劑發(fā)揮治療作用與中醫(yī)證候之間密切相關(guān)，甘草附子湯有散寒除濕止痛之功，用于寒濕證疼痛有更好的治療作用，此研究為方證相關(guān)理論提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。