日糧中添加黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞免疫器官組織結(jié)構(gòu)及腸道結(jié)構(gòu)的影響

梁 銳，王佳敏，崔小珍，王延?xùn)|，王穎莉

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料獸藥研究所，山西太原030032；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州510642）

禽流感的預(yù)防和治療是國(guó)家防治的重點(diǎn)，為確保不發(fā)生區(qū)域性高致病性禽流感等重大動(dòng)物疫情，中華人民共和國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部于2020年2月29日發(fā)布了《高致病性禽流感疫情應(yīng)急實(shí)施方案（2020年版）》，協(xié)同打贏新型冠狀病毒感染的肺炎疫情防控阻擊戰(zhàn)［1］。H5和H7亞型禽流感病毒成為感染的重點(diǎn)，提高機(jī)體免疫功能成為防治的重點(diǎn)，機(jī)體免疫力的強(qiáng)弱取決于免疫器官狀況。研究表明，大多數(shù)中草藥具有增強(qiáng)免疫力的作用，如黃芪、甘草、黨參等。其中黃芪多糖促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖與分化，增加胞漿細(xì)胞分泌，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群平衡，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫［2］。甘草葡聚糖刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖，甘草酸可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能和細(xì)胞免疫功能［3］。黨參能顯著提高血清抗體效價(jià)，從而增強(qiáng)體液免疫［4］。黃芪復(fù)方主要由黃芪、甘草、黨參等組成，制備成顆粒便于與日糧復(fù)配。本實(shí)驗(yàn)旨在研究日糧中添加黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、免疫及抗氧化功能的影響，為其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑 黃芪復(fù)方顆粒（自制，由黃芪、甘草等水回流提取濃縮成膏狀制粒）；蘇木素染液色（湖北安立信醫(yī)療實(shí)驗(yàn)有限公司）、伊紅染液色（湖北安立信醫(yī)療實(shí)驗(yàn)有限公司）、二甲苯、乙醇、中性樹膠、染色缸、載玻片、蓋玻片（江蘇飛舟玻塑有限公司）。

1.1.2 儀器 LEICAIP 1020全自動(dòng)組織脫水機(jī)（德國(guó)萊卡）、LECIA RM2265全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)萊卡）、LECIA DM2500 LED研究級(jí)熒光顯微圖像系統(tǒng)（德國(guó)萊卡）、YD-6L生物組織冷凍臺(tái)（德國(guó)萊卡）、YD-6L生物組織包埋機(jī)（德國(guó)萊卡）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用100羽1日齡公母混合羅斯308肉雞適應(yīng)性飼喂7 d后，稱重并隨機(jī)分成4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5羽，每組25羽羅斯肉雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，參照美國(guó)羅斯308肉雞營(yíng)養(yǎng)需要，實(shí)驗(yàn)1～21 d采用肉小雞顆粒料，21～42 d采用肉中雞配合料，飼料購(gòu)于文水縣大象禽業(yè)象豐飼料有限公司。基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。實(shí)驗(yàn)組于第21天開始在日糧中添加黃芪復(fù)方顆粒，分別于飼料中添加0.87%、1.74%、3.48%黃芪復(fù)方顆粒，實(shí)驗(yàn)周期42 d。

表1 基礎(chǔ)日糧配方

1.2.2 飼養(yǎng)管理 采用三層籠養(yǎng)，紅外燈保溫，各組分別隔離飼養(yǎng)，自由采食和飲水，于第20天接種新支二聯(lián)多價(jià)疫苗。

1.2.3 樣品采集與處理 肉雞飼喂至42 d，立即剖檢法氏囊、脾臟和十二指腸等組織樣品，經(jīng)生理鹽水洗凈后置于4%的多聚甲醛固定液中，乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋、切片（5～7 μm）、HE染色和中性樹膠封片，在LED研究級(jí)熒光顯微圖像系統(tǒng)下觀察、拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)組分別測(cè)量3個(gè)差異個(gè)體的3～5個(gè)數(shù)據(jù)，各指標(biāo)取平均數(shù)做方差分析作為測(cè)定數(shù)據(jù)。用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（或標(biāo)準(zhǔn)差），以P＜0.05作為顯著差異判斷標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.01作為極顯著差異判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞法氏囊組織結(jié)構(gòu)的影響

與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組法氏囊淋巴濾泡的面積增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見圖 1、表 2。

表2 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞法氏囊組織結(jié)構(gòu)的影響(±s)

表2 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞法氏囊組織結(jié)構(gòu)的影響(±s)

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.01

組別 淋巴濾泡面積（μm2）對(duì)照組 10 120.01±2 606.44 0.87%組 12 234.78±2 978.961）1.74%組 14 128.24±3 724.571）3.48%組 18 693.23±4 078.701）

圖1 肉雞法氏囊組織淋巴濾泡

2.2 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組中央動(dòng)脈周圍淋巴鞘明顯增厚，鞘內(nèi)淋巴細(xì)胞密集；淋巴小結(jié)不斷分裂，出現(xiàn)生發(fā)中心。與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組雞的脾小結(jié)面積增加，動(dòng)脈周圍淋巴鞘直徑增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見圖 2、表 3。

表3 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(±s)

表3 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(±s)

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 脾小結(jié)面積（μm2） 動(dòng)脈周圍淋巴鞘直徑（μm）對(duì)照組 783.80±165.52 9.44±1.35 0.87%組 1 138.07±390.112） 11.66±2.901）1.74%組 1 379.95±469.202） 13.01±2.732）3.48%組 1988.04±409.982） 18.02±2.782）

2.3 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞十二指腸結(jié)構(gòu)的影響

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組十二指腸組織均完整清晰，囊內(nèi)淋巴小結(jié)形態(tài)完整清晰，皮質(zhì)與髓質(zhì)易分辨。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組絨毛高度較大，排列較為緊密，腸腔體較小。尤其中劑量組腸壁完整、絨毛較長(zhǎng)。結(jié)果見圖 3～圖 4。

圖2 肉雞脾臟組織結(jié)構(gòu)

圖3 十二指腸組織結(jié)構(gòu)

圖4 十二指腸顯微結(jié)構(gòu)

與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組雞的十二指腸的腸壁厚度及絨毛高度增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組隱窩深度均降低，0.87%組與對(duì)照組比較，隱窩深度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞法氏囊組織結(jié)構(gòu)的影響

法氏囊的發(fā)育與外周免疫器官的發(fā)育密切相關(guān)，法氏囊淋巴濾泡數(shù)量越多，面積越大，髓質(zhì)面積所占比例增加［5］。法氏囊淋巴濾泡由外圍的髓質(zhì)和中央皮質(zhì)以及介于二者之間的層皮-髓邊界細(xì)胞組成，淋巴濾泡內(nèi)含有豐富的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，隨著淋巴濾泡面積的增加，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量也在增加［6］。

表4 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞十二指腸結(jié)構(gòu)的影響(±s)

表4 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞十二指腸結(jié)構(gòu)的影響(±s)

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 腸壁厚度（μm） 絨毛高度（μm） 隱窩深度（μm）對(duì)照組 52.11±4.65 180.87±17.38 45.89±1.68 0.87%組 50.13±4.701） 231.24±30.632） 38.87±5.642）1.74%組 59.55±4.271） 291.14±40.972） 44.64±17.75 3.48%組 62.67±6.951） 214.18±16.192） 39.27±13.37

3.2 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

脾臟為家禽中最大的淋巴器官，由紅髓和白髓組成。白髓由脾小結(jié)和動(dòng)脈周圍淋巴鞘組成，脾小結(jié)位于動(dòng)脈周圍淋巴鞘附近。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞免疫反應(yīng)時(shí)，動(dòng)脈周圍淋巴鞘內(nèi)的T細(xì)胞大量增殖，動(dòng)脈周圍淋巴鞘將會(huì)增厚；而發(fā)生體液免疫時(shí)，脾小結(jié)將增大，生發(fā)中心明顯，脾索內(nèi)漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量增加［7］。此外，脾臟作為外周免疫器官，通過動(dòng)脈周圍淋巴鞘和橢球體間相互作用來(lái)對(duì)T依賴性抗原產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答［5］。動(dòng)脈周圍淋巴鞘主要由密集的T淋巴細(xì)胞、散在的巨噬細(xì)胞和交錯(cuò)突細(xì)胞等環(huán)繞動(dòng)脈而成，動(dòng)脈周圍淋巴鞘屬胸腺依賴區(qū)，當(dāng)發(fā)生細(xì)胞免疫應(yīng)答時(shí)，此區(qū)明顯增厚［8］。

3.3 黃芪復(fù)方顆粒對(duì)肉雞十二指腸結(jié)構(gòu)的影響

小腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的重要場(chǎng)所，其中絨毛高度和隱窩深度是決定消化吸收的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是評(píng)價(jià)腸道形態(tài)的關(guān)鍵參數(shù)［9］。腸絨毛是腸黏膜表層上皮和固有層向腔內(nèi)的突起，隨著小腸絨毛高度增加，腸吸收表面積增加，腸上皮細(xì)胞數(shù)量增多，消化酶分泌增多，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收率提高；絨毛長(zhǎng)度變短時(shí)，成熟細(xì)胞少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收能力低。隱窩深度決定了腸絨毛通過有絲分裂產(chǎn)生上皮細(xì)胞的速度，主要功能是分泌消化液，隱窩深度變淺，表明腸上皮細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強(qiáng)。絨毛高度/隱窩深度則綜合反映腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，反映腸黏膜的吸收能力，當(dāng)比值下降表明消化、吸收能力下降，比值上升表明消化、吸收能力增強(qiáng)［10-12］。