桂枝茯苓丸對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的防治作用及機制研究

郭文娟 ，王 青 ，劉建春 ，姜維佳 ，何奕佳 ，肖保國 ，馬存根 ，2

（1.山西中醫藥大學“2011”協同創新中心/神經生物學研究中心，山西晉中030619；2.大同大學腦科學研究所，山西大同037009； 3.復旦大學華山醫院神經病學研究所，上海200025）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是以中樞神經系統（central nervous system，CNS）白質炎性脫髓鞘病變為特點的自身免疫性疾病，呈慢性病程，傾向于青壯年罹患。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmuneencephalomy elitis，EAE）與MS在臨床、病理、免疫等方面具有許多相似的特征，被認為是研究MS的經典動物模型。迄今為止MS尚無有效的治療手段，長期激素、免疫抑制劑等治療雖能改善部分患者癥狀，但不良反應較大［1］。

中醫學通過對MS的探索研究認為，本虛標實是其基本特征，血瘀證為MS辨證論治中的常見證型，活血能明顯改善臨床癥狀［2］。桂枝茯苓丸出自《金匱要略》，方中桂枝、茯苓、丹皮、芍藥、桃仁各等分，全方燮理陰陽、調和肝脾腎、活血化瘀、溫通經脈、和營止痛，與MS本虛標實、血瘀之病機切合，臨床上桂枝茯苓丸用于瘀阻脈絡的神經系統疾病療效顯著［3-4］。

近年現代藥理實驗研究發現：桂枝茯苓丸在臨床應用中具有增強免疫、抗炎、調節激素水平、降低血黏稠度、抗組織增生、神經保護及改善腎功能等作用［5］。復方桂枝茯苓丸能降低腦缺血再灌注大鼠血清中促炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、內皮素（ET）的含量［6］。赤芍的主要成分為芍藥苷（paeoniflorin，PF），PF通過抗氧化和神經保護作用能使EAE小鼠脊髓內神經炎性反應緩解［7］。本研究用桂枝茯苓丸干預EAE小鼠，初探其防治作用及部分可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級雌性8～10周齡C57BL/6小鼠24只，體質量約18～20 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2016-0011。實驗前小鼠在無病原菌動物房（25℃左右）飼養，期間自由喂食飲水1周。

1.1.2 藥物 桂枝茯苓丸（GZFLW）：山西天生制藥有限責任公司，6 g/丸，批號：116002。桂枝茯苓丸藥物制備：將藥物研磨加入開水攪拌。桂枝茯苓丸高劑量組（GZFLWL）8 g/kg灌胃（按臨床劑量40倍計算，相當于臨床等效量的4倍），每日2次，0.5 mL/次；中劑量組（GZFLWM）4 g/kg灌胃（按臨床劑量20倍計算，相當于臨床等效量的2倍），每日 1 次，0.5 mL/次；低劑量組（GZFLWL），2 g/kg（按臨床劑量10倍計算，相當于臨床等效量）灌胃，每日 1 次，0.25 mL/次。

1.1.3 試劑與儀器 髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35～55多肽（myelin oligodendrocyte glycoprotein 33～55 peptide，MOG35～55）：上海強耀生物科技有限公司，5.0 mg/支，純度 98.39%，批號 9001；結核分枝桿菌：美國DIFCO公司，100 mg/支，批號231141；完全弗氏佐劑（Complete Freund′s Adjuvant）：美國Sigma公司，10 mL/支，批號 60103；ELISA試劑盒［白介素-6（IL-6），批號 100405；TNF-α，批號102007）］：美國PEPROTECH公司；酶聯免疫檢測儀（SYNERGY/H 1）：美國伯騰儀器有限公司。二氧化碳培養箱：美國Thermo公司；電子秤：北京塞多利斯科學儀器廠；Millipore純水機：美國Millipore公司；臺式離心機：上海滬上儀器，DL-L8M；低溫臺式離心機（3～18 K）：美國 SIGMA 公司；移液槍：美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 雌性C57BL/6小鼠實驗前在無特殊病原菌實驗室自由飲食喂養1周后，按體質量隨機分為桂枝茯苓丸高、中、低劑量組及EAE模型組（EAE），每組8只。

1.2.2 EAE模型制備及給藥 MOG35-55抗原乳劑的配制和注射均嚴格按照文獻［8］的方法進行。稱取5 mg MOG35-55溶解于1 mL 0.9%氯化鈉溶液中，6 mg TB溶于1 mL CFA；然后將兩種溶液充分混合，制成油包水樣抗原乳劑。在小鼠脊柱腰骶膨大處背側中線兩側分4點皮下注射抗原乳劑0.1 mL，在免疫當日和免疫48 h后每只小鼠腹腔注射百日咳毒素（PTX）300 ng/次以增強免疫反應。小鼠出現尾部肌張力下降癥狀為EAE發病起始，即模型制備成功［9］。

桂枝茯苓丸干預組于免疫后第3天，給予高、中、低劑量灌胃持續至免疫后第28天。EAE模型組以0.5 mL/只生理鹽水灌胃。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 神經功能評分 采用國際通用的5分制評分標準進行臨床評分。癥狀介于兩標準之間者以±0.5 分計［10］。

表1 臨床評分標準

1.3.2 一般指標 自免疫當日開始隔日測量實驗動物體重。

1.3.3 炎性因子檢測 免疫后第28天，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠（0.2 mL/只）后用滅菌手術器械取脾，放入高糖無菌培養液中制備單個核細胞懸液。細胞計數后取部分細胞培養（37℃，5%CO2）48 h后取上清液，ELISA法檢測脾細胞上清液炎性因子IL-6、TNF-α含量。

1.3.4 病理組織 4%多聚甲醛灌流進行體內組織固定，然后分離脊髓，OCT包埋劑包埋，于液氮中冷凍，做厚度為10 μm的冰凍切片，進行脊髓髓鞘染色和HE染色。

1.4 統計學方法

采用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，臨床癥狀評分組間比較采用秩和檢驗，其余組間比較采用單因素方差分析，率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對EAE神經功能評分的影響

EAE模型組小鼠于免疫后第12天開始起病，免疫后第22天左右達到高峰。實驗數據表明，與模型組比較，桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均可減輕EAE臨床癥狀，降低神經功能評分（P＜0.01），以中劑量組效果最優。故后續實驗以中劑量為最終給藥劑量，后續實驗稱為桂枝茯苓丸組。結果見圖1。

圖1 對EAE神經功能評分的影響

2.2 對EAE小鼠體質量的影響

從免疫開始到免疫后第10天左右，EAE模型組小鼠與桂枝茯苓丸組小鼠體質量差異不明顯（P＞0.05），第10～26天兩組小鼠體質量差異變大，EAE模型組臨床癥狀加重，體質量明顯降低，而桂枝茯苓丸組小鼠體質量減輕不明顯，其差異具有統計學意義（P＜0.01）。結果見圖2。

圖2 對EAE小鼠體質量的影響

2.3 對EAE小鼠脊髓炎性細胞浸潤和髓鞘脫失的影響

HE染色10倍鏡下顯示，臨床癥狀較重的EAE模型組小鼠脊髓有大量炎性細胞浸潤，桂枝茯苓丸組可有效抑制EAE小鼠脊髓炎性細胞浸潤（P＜0.01）。髓鞘染色積分光密度IOD顯示，EAE模型組小鼠脊髓有明顯的片狀脫髓鞘區（圖中藍顏色部分為白質，是髓鞘脫失的病理部位，藍顏色中白色部分即為脫髓鞘），而桂枝茯苓丸組小鼠髓鞘脫失較輕（P＜0.05）。結果見圖3。

圖3 對EAE小鼠脊髓炎性細胞浸潤和髓鞘脫失的影響

2.4 對EAE小鼠炎性因子TNF-α和IL-6含量的影響

桂枝茯苓丸組脾細胞培養上清液中TNF-α、IL-6濃度明顯低于EAE模型組，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。表明桂枝茯苓丸可有效抑制EAE小鼠外周免疫炎癥反應。結果見圖4。

圖4 對EAE小鼠炎性因子TNF-α和IL-6含量的影響

3 討論

桂枝茯苓丸出自《金匱要略》，臨床上桂枝茯苓丸用于瘀阻脈絡的神經系統疾病療效顯著［3-4］。本研究結果表明桂枝茯苓丸可延遲EAE小鼠的發病時間，減輕臨床癥狀，尤其是桂枝茯苓丸中劑量組效果更為明顯。

MS/EAE病理過程的重要環節是炎性細胞大量浸潤造成中樞組織破壞，出現髓鞘脫失。T淋巴細胞中樞浸潤是誘發MS/EAE免疫病理過程的重要因素，活化的T淋巴細胞在CNS抗原遞呈細胞作用下引起免疫炎癥反應放大，形成中樞炎性微環境［10］，造成少突膠質細胞修復不足等。實驗結果HE染色顯示，桂枝茯苓丸可有效減少炎性細胞向CNS遷移和聚集，進而減輕髓鞘脫失。

在MS發病過程中，TNF-α為病變的促發因子，可誘導多種黏附分子、趨化因子、細胞因子（如IL-1，IL-6）等分泌，促進炎性介導物釋放、活化巨噬細胞等。IL-6是一種強有力的促炎性細胞因子，對病原體的宿主防御和急性應激起著舉足輕重的作用。促炎因子TNF-α、IL-6等由Th1細胞分泌，這類促炎因子介導少突膠質細胞損傷，誘導髓鞘降解，啟動炎性反應［11-13］。本實驗結果表明，桂枝茯苓丸可能通過抑制炎性因子分泌減輕炎性反應，調節機體免疫應答。

本實驗結果表明，桂枝茯苓丸可延緩EAE發病時間、改善EAE神經功能評分、減少EAE小鼠體重丟失、減輕病灶的炎性細胞浸潤，其機制可能與降低炎性因子分泌，調節機體免疫有關。這為進一步探索桂枝茯苓丸的抗炎、調節免疫功能提供了研究基礎，也為臨床應用桂枝茯苓丸通調陰陽，活血化瘀治療MS提供了實驗基礎。