黃芩苷對老年人骨髓間充質干細胞增殖能力和凋亡水平的影響及機制

翟曉艷，裴 亮，周儒奎，楊 蓉，楊李旺，趙煥新，季新燕，張育敏，儲開博

（1.山西中醫藥大學解剖教研室，山西晉中030619； 2.山西醫科大學第二醫院泌尿外科，山西太原030001；3.山西中醫藥大學生理教研室，山西晉中030619）

干細胞是一類具有自我更新和多向分化能力的未分化細胞，在組織修復方面起重要作用。干細胞移植治療已經被公認為多種疾病的有效治療方法，例如韌帶損傷、骨損傷、軟骨損傷和心肌梗死等，然而在老年患者的應用效果欠佳［1］。究其原因，年齡是重要原因之一，年齡可以引起干細胞數量減少以及增殖能力下降、凋亡水平增高——呈現出衰老的表型，影響干細胞的治療效果［2］。因此，使老年干細胞年輕化、提高干細胞的活性是有效解決老年患者干細胞移植應用的有效途徑之一。

有研究報道，黃芩苷可清除活性氧成分、超氧自由基，起到抗氧化的作用，同時對于抗凋亡也有作用［3-4］。而細胞衰老的過程中，活性氧成分和超氧自由基積累增多是重要的原因之一［2］。但是黃芩苷對于老年骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBM-MSCs） 的作用目前還未見報道。本實驗擬研究黃芩苷對于老年hBM-MSCs增殖能力和凋亡水平的作用，為改善老年干細胞自體移植治療提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物與試劑 黃芩苷（西安原生植物技術有限公司，純度 98%）。Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium（IMDM）細胞培養基、澳洲胎牛血清（Gibco，美國）；0.25%胰酶（索萊寶，中國）；CCK-8試劑盒（Dojindo，日本）；Bcl-2、Bax一抗（Santa Cruz，美國）；ACTB、caspase 3一抗（Cell Signaling Technology，美國）；辣根標記山羊抗兔IgG、辣根標記山羊抗小鼠IgG（北京中杉，中國）；高靈敏度化學發光（ECL）檢測試劑盒（漢恒生物科技，中國）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）；DUB00型核酸蛋白分析儀（Beckman Coulter公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 老年hBM-MSCs的培養 取自山西醫科大學第一、二附屬醫院血液科（排除惡性腫瘤）8例老年患者骨髓，55～81歲，平均年齡（63.23±2.71）歲。本研究已經通過山西中醫藥大學倫理委員會審查（批件號2019LL186），受試者均簽署知情同意書。獲得骨髓后，將新鮮的骨髓1 mL中加入10 mL含有10%FBS IMDM培養基中，接種到100 mm2的培養皿中，48 h后換液培養，待細胞達到80～90%融合時，將細胞以5000細胞/cm2的密度傳代。本實驗中所用的細胞均為P4代細胞。

1.2.2 CCK-8法檢測黃芩苷的細胞毒性 本實驗用CCK-8試劑盒檢測黃芩苷對老年hBM-MSCs的細胞毒性作用。將老年hBM-MSCs分為8個濃度，每個濃度 3個復孔（分別為0 μM/L、0.5 μM/L、1 μM/L、10 μM/L、50 μM/L、100 μM/L、500 μM/L、1000 μM/L）以1000細胞/孔的密度分別接種到96孔板中，加入含10%FBS IMDM培養基中貼壁過夜后，換液為不同濃度黃芩苷（0、0.5、1、10、50、100、500、1000μM/L）+10%FBSIMDM培養基，37℃、5%CO2培養箱中培養3 d后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，在37℃、5%CO2培養箱中孵育2 h，用酶標儀測定450 nm波長處的吸光值（A值），每例細胞3個復孔，取均值代表細胞毒性，參比波長為600 nm。

1.2.3 細胞計數法檢測細胞的增殖能力 將老年hBM-MSCs分為4個濃度，每個濃度8例細胞，每例細胞每個濃度3個復孔（分別為0 μM/L、0.5μM/L、1 μM/L、10 μM/L） 以 7000 細胞/孔的密度接種到12孔板中，分別加入黃芩苷濃度為0、0.5、1、10 μM/L 的 10%FBS IMDM 培養基，在培養 0、2、4、6、8 d 后，用 0.25%胰酶消化后計數細胞。

1.2.4 Annexin-V和PI染色法檢測細胞的凋亡水平 將老年hBM-MSCs分為兩組（對照組和黃芩苷組，每組8例細胞，每例細胞3個復孔），將細胞以 105/mL 的密度接種，分別加入含 0 μM/L、1 μM/L黃芩苷的培養基，在細胞培養至6 d時，收集細胞用 1000 μM H2O2處理 6 h，用 Annexin-V 和 PI染色（Life Technologies），流式細胞儀檢測細胞凋亡水平，凋亡細胞為Annexin-V陽性細胞。

1.2.5 Western免疫印跡法檢測Bax、Bcl-2和caspase 3蛋白相對水平的表達 將老年hBM-MSCs分為兩組（對照組和黃芩苷組，每組8例細胞，每例細胞3個復孔），將細胞以1×105/mL的密度接種，分別加入含 0 μM/L、1 μM/L 黃芩苷的培養基，在細胞培養至6 d時，收集細胞用1000 μM/L H2O2處理6 h后，用RIPA蛋白裂解液提取對照組和黃芩苷組細胞的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，取30 μL蛋白經12%SDS凝膠電泳后，轉移至PVDF膜上，加5%脫脂牛奶4℃封閉過夜后，分別加入一抗兔抗人 Bax（1∶200）、一抗兔抗人Bcl-2（1∶200）、一抗兔抗人 cleaved caspase 3（1∶1000）、一抗鼠抗人 ACTB（1∶1000），4 ℃過夜孵育，加入1∶2000辣根過氧化物酶標記的二抗，最后加入ECL顯影液，用圖像分析系統采圖，Image J軟件以ACTB為內參分析相對灰度值，蛋白相對表達水平=目標蛋白灰度值/ACTB灰度值。

1.2.6 SOD和MDA含量的測定 將以上1.2.5處理的細胞用細胞刮收集，清洗離心后超聲粉碎，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒和丙二醛（MDA）檢測試劑盒說明書檢測SOD和MDA的含量。

1.3 統計學方法

所有數據均用統計軟件使用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析。實驗數據均為計量資料，以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t-test檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩苷的細胞毒性

本實驗用CCK-8法檢測黃芩苷對老年hBM-MSCs的細胞毒性。用不同濃度的黃芩苷（0.1-1000 μM/L）處理老年 hBM-MSCs。從實驗中觀察到，當用含有 0.5、1、10 μM/L 黃芩苷的IMDM培養基培養人骨髓間充質干細胞3 d時呈現最小細胞毒性。而在培養基中黃芩苷濃度大于50 μM/L時，細胞的存活率與對照組比較（IMDM培養基中黃芩苷濃度為0 μM/L）均明顯下降（P＜0.01），出現明顯細胞毒性表現（圖1）。因此黃芩苷對干細胞增殖能力實驗中所用黃芩苷濃度為0.5、1、10 μM/L。

圖1 黃芩苷（baicalin）對老年hBM-MSCs的細胞毒性

2.2 黃芩苷對老年hBM-MSCs增殖能力的影響

本實驗通過計數法研究發現（圖2）：與對照組（0 μM/L）比較，在第 2天和第 4天，3個不同濃度黃芩苷組老年hBM-MSCs的數量沒有顯著差異，但是在第6天和第8天則數量顯著增多（P＜0.01）。這說明黃芩苷能提高老年hBM-MSCs的增殖能力。其中1 μM/L和10 μM/L黃芩苷對骨髓間充質干細胞的增殖能力影響較0.5 μM/L黃芩苷的作用更大（P＜0.05）。而 1 μM/L 和 10 μM/L 兩組黃芩處理組之間并無顯著差異。因此以下實驗中所用的黃芩苷的濃度均為1 μM/L。

圖2 黃芩苷（baicalin）對老年hBM-MSCs增殖能力的影響

2.3 黃芩苷對老年hBM-MSCs凋亡水平的影響

空白組老年hBM-MSCs的凋亡率（Annexin-V陽性細胞率）為（30.4±4.43）%，黃芩苷組凋亡率（24.9±2.68）%，黃芩苷組的凋亡水平顯著低于對照組（P＜0.01），這說明黃芩苷對老年hBM-MSCs具有抗凋亡的作用。結果見圖3。

通過Western印跡法對凋亡相關蛋白的檢測發現（圖4，表1），與對照組比較，黃芩苷組clesved caspase 3（caspase 3的裂解產物）和促凋亡蛋白Bax蛋白水平表達下降，而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 黃芩苷對老年hBM-MSCs凋亡相關蛋白Bax、caspase 3和Bcl-2蛋白表達水平的影響 （±s）

表1 黃芩苷對老年hBM-MSCs凋亡相關蛋白Bax、caspase 3和Bcl-2蛋白表達水平的影響 （±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05

Group n Bax Cleaved caspase 3 Bcl-2 Control group 8 1.204±0.214 0.375±0.012 0.734±0.291 Baicalin group 8 0.433±0.1051） 0.122±0.0331） 1.539±0.2391）

2.4 黃芩苷對老年hBM-MSCs中SOD和MDA含量的影響

圖3 黃芩苷對老年hBM-MSCs凋亡水平的影響

圖4 黃芩苷對老年hBM-MSCs凋亡相關蛋白Bax、caspase 3和Bcl-2蛋白表達水平的影響

與對照組比較，超氧化物歧化酶（SOD）的含量顯著增高（P＜0.05），而丙二醛的含量則顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見表2。

表2 黃芩苷對老年hBM-MSCs中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的影響（±s）

表2 黃芩苷對老年hBM-MSCs中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的影響（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05

Group n SOD（U/mg） MDA（nmol/mg）Control group 8 72.30±14.32 5.05±1.09 Baicalin group 8 97.86± 0.1051） 2.94±0.831）

3 討論

骨髓間充質干細胞由于其來源豐富、取材方便、低免疫性等優勢成為干細胞最主要的來源之一。研究發現，隨著年齡的增長，hBM-MSCs呈現出衰老的表型，增殖能力和抗氧化應激能力均下降，凋亡水平升高。因此老年hBM-MSCs自體移植的應用在很多領域受到了局限［3，5］。隨著全球人口老齡化時代的到來，如何使老年hBM-MSCs更加年輕化，使其增殖能力和抗氧化應激能力提高、凋亡水平下降，從而提高修復能力、改善老年hBMMSCs自體移植治療效果日益重要。

黃芩（baicalin，C21H18O11），別名黃芩苷，化學名為5，6-二羥基-7-O-葡萄糖醛酸黃酮苷，是從黃芩根中提取出來的一種黃酮類化合物，具有廣泛的生物活性，并且毒性低、安全范圍廣，藥物來源方便且豐富（黃芩為山西的道地藥材之一），具有廣闊的發展前景。大量的研究發現：黃芩苷具有抗氧化應激的作用，黃芩苷在結腸炎、鎘誘導的肝細胞毒性、缺血-再灌注后的心肌損傷和腦外傷的應用中均表現出保護作用，而這些保護作用都是通過抗氧化應激作用來實現的［3-4，6-7］。氧化應激是引起細胞衰老過程中的關鍵步驟之一［2］，但是目前對于黃芩苷對hBM-MSCs的作用國內外還未見報道。本研究以黃芩苷為靶點，探討使老年hBM-MSCs年輕化的方法。本研究結果發現：將1 μM/L的黃芩苷作用于H2O2誘導的老年hBMMSCs，使脂質過氧化物MDA表達下降，過氧化物歧化酶 SOD 表達升高，與研究報道一致［3-4，6-7］。因此我們得出結論：黃芩苷對老年hBM-MSCs具有抗氧化應激作用，黃芩苷可能是老年hBM-MSCs年輕化的靶點。

本研究首先進行黃芩苷對老年hBM-MSCs的毒性作用實驗，結果表明，當用含有 0.5、1、10 μM/L黃芩苷的IMDM培養基培養老年hBM-MSCs時呈現最小細胞毒性。因此本研究在做細胞增殖實驗時，分別用0.5、1、10 μM/L的黃芩苷作用于老年hBM-MSCs，結果發現：黃芩苷可以促進老年hBM-MSCs的增殖能力。1、10 μM/L的黃芩苷作用于老年hBM-MSCs，其增殖能力高于0.5 μM/L。而1 μM/L與10 μM/L黃芩苷作用于老年hBMMSCs，其增殖能力沒有顯著差異，因此將1 μM/L的黃芩苷作為最適濃度。Zuo Wenpu等［8］研究發現黃芩苷對于施萬細胞有促進其增殖能力的作用。李蓉等［9-10］研究發現黃芩苷可以促進大鼠海馬神經干細胞的增殖，從而改善缺血再灌注損傷后的認知和記憶功能的障礙。但是也有部分研究與本研究結果相反，Wang Jian等［11］發現黃芩苷通過抑制miR-294的表達抑制小鼠胚胎干細胞的增殖。通過對比分析發現：上述研究黃芩苷濃度均在100 μM/L以上，遠遠高于本實驗中所使用的濃度，這可能是產生結果不一致的原因之一，也有可能是細胞種類的不同、實驗條件的不同等，但這些都有待進一步的研究證實。

Fang Jiang等［3］研究發現黃芩苷具有抗凋亡的作用：于腦外傷的小鼠腹腔注射黃芩苷后，全腦凋亡陽性細胞減少，同時抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，促凋亡蛋白Bax和caspase 3表達下降。Yao Jun等［4］發現黃芩苷作用于結腸炎大鼠模型，可以使結腸上皮細胞凋亡陽性細胞減少，同時抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，促凋亡蛋白Bax和TGF-β表達下降。本研究結果證實：黃芩苷作用于老年hBM-MSCs后，凋亡細胞陽性率下降，同時抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，促凋亡蛋白Bax和caspase 3表達下降。

綜上所述，黃芩苷具有促進老年hBM-MSCs呈現出年輕化的表現，即增殖能力增強，凋亡水平下降，而這些作用可能是通過修復抗氧化應激能力實現的，本研究為改善老年干細胞自體移植治療效果提供了實驗基礎。