六硝基六氮雜異伍茲烷對體外哺乳動物細(xì)胞致突變性研究

趙彬　范小琳　盧青　劉志永　高俊宏

摘 要：目的：通過體外哺乳動物細(xì)胞TK基因突變試驗和體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗研究六硝基六氮雜異伍茲烷（CL-20）的細(xì)胞致突變性。方法：在非代謝活化（-S9）和代謝活化（+S9）條件下，CL-20處理L5178Y細(xì)胞和CHL細(xì)胞，進行基因突變試驗和染色體畸變試驗。結(jié)果：以500、250、125?g/mL濃度的CL-20處理L5178Y細(xì)胞，各劑量組突變頻率（MF）具有劑量相關(guān)性，且500?g/mL劑量組的MF是溶劑對照組的2倍以上;以500、250、125?g/mL濃度處理CHL細(xì)胞，各劑量組染色體畸變細(xì)胞率與溶劑對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：CL-20可能對小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞TK基因具有致突變性，對中國倉鼠肺CHL細(xì)胞染色體無致突變性。

關(guān)鍵詞：六硝基六氮雜異伍茲烷（CL-20）;TK基因突變;染色體畸變

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CL-20由中國近代化學(xué)研究所提供。

L5178Y TK+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤細(xì)胞、CHL中國倉鼠肺細(xì)胞，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

RPMI1640培養(yǎng)基，馬血清購自GIBCO公司，秋水仙堿、Giems等均購自成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司，三氟胸苷（TFT）、甲基甲烷磺酸乙酯（MMS）、環(huán)磷酰胺（CP）等均購自Sigma公司。

潔凈工作臺（西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國SHELLAB公司）、倒置顯微鏡（德國蔡司公司），低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因突變試驗

取清除自發(fā)突變，生長良好的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×105/mL，按1%體積加入受試物（需代謝活化的情況下，同時加入終濃度為1%的S9混合物），37℃振搖處理3h，以1000r/min的速度離心5min，棄去上清液，用PBS洗滌，重懸，并調(diào)整密度為2×105/mL。

取適量上述細(xì)胞懸液，稀釋至8個細(xì)胞/mL，接種96孔板（每孔0.2mL），每個劑量種1塊平板，培養(yǎng)12d，計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。

取適量上述細(xì)胞懸液，作2d表達培養(yǎng)，每天計數(shù)細(xì)胞密度并保持密度在106/mL以下。

表達培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細(xì)胞懸液，稀釋至8個細(xì)胞/mL，接種96孔板（每孔加入0.2mL），每個劑量種1塊平板，培養(yǎng)12d，計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù)。

表達培養(yǎng)結(jié)束后，另取適量細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，加入TFT，混勻，接種96孔板（每孔加入0.2mL），每個劑量作3塊平板，培養(yǎng)12d，計數(shù)有突變集落生長的孔數(shù)。

1.2.2 染色體畸變試驗

取生長良好的1×106個細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，加入一定濃度受試物（需代謝活化的情況下，同時加入終濃度為1%的S9混合物）。置于培養(yǎng)箱內(nèi)處理6h。處理結(jié)束后，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌，加入完全培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，24h后收獲細(xì)胞。收獲前4h，加入秋水仙素溶液。收獲細(xì)胞后，低滲、固定、滴片、染色后制成染色體標(biāo)本。顯微鏡下隨機觀察不少于200個分散良好的中期分裂相。

1.3 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

1.3.1 數(shù)據(jù)處理

平板效率（PE0、PE2）：

式中：

EW-無集落生長的孔數(shù);

TW-總孔數(shù);

1.6-每孔接種細(xì)胞數(shù)。

相對存活率（RS）：

突變頻率（MF）：

式中：

EW-無集落生長的孔數(shù);

TW-總孔數(shù);

N-每孔接種細(xì)胞數(shù)（2000）;

PE2-第2天的平板效率。

1.3.2 結(jié)果分析

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。基因突變試驗受試物的突變頻率比陰性對照高2倍或以上，并有劑量效應(yīng)，可判定為陽性結(jié)果。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CL-20對L5178Y細(xì)胞基因突變試驗

CL-20對小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞TK基因的致突變性結(jié)果見表1。由表1可知，在不加或加S9活化情況下，相對存活率（RS0）隨著劑量的增加而減小，說明CL-20對L5178Y細(xì)胞具有一定毒性，且呈現(xiàn)劑量--反應(yīng)關(guān)系。陽性對照MMS的MF顯著高于溶劑對照組。隨著CL-20處理劑量的增加，MF呈上升趨勢，具有劑量相關(guān)性，且500?g/mL劑量組的MF是溶劑對照組的2.02和2.76倍。

2.2 CL-20對CHL細(xì)胞染色體畸變試驗

CL-20對倉鼠肺CHL細(xì)胞染色體的致突變性結(jié)果見表2。由表2可知，在本實驗條件下，在有S9和無S9情況下，陽性對照組染色體畸變細(xì)胞率均明顯增加，分別與溶劑對照組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而CL-20低、中、高劑量組染色體畸變率與溶劑對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

本次實驗采用的是具有較高的檢出靈敏度、較廣的檢測譜且簡便易行的體外短期致突變試驗方法。實驗選取的CL-20劑量為500、250、125?g/mL，在此劑量下，CL-20可能對小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞TK基因具有致突變性。而在相同劑量條件下，CL-20對倉鼠肺CHL細(xì)胞染色體無致突變性。遺傳毒性試驗檢測方法眾多，根據(jù)試驗檢測的遺傳終點可分為三類：檢測基因突變;檢測染色體畸變和檢測DNA原始損傷。由于沒有任何單一的檢測方法能涵蓋所有的遺傳學(xué)終點，因此需要采用體內(nèi)和體外多種試驗方法組合全面評估受試物的遺傳毒性風(fēng)險。在前期研究中，我們通過Ames試驗、小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗，發(fā)現(xiàn)CL-20可能具有遺傳毒性。本次體外基因突變試驗結(jié)果，進一步證明了CL-20具有一定遺傳毒性。

體外哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗和體外哺乳動物細(xì)胞染色體畸變試驗可以用于篩選可能的哺乳動物致癌物。因此本次試驗結(jié)果表明，CL-20可能具有潛在的致癌性，應(yīng)進一步進行致癌實驗研究。

通過此次試驗研究，進一步證明了CL-20的致突變性，完善了其毒性安全性評價基礎(chǔ)資料，為進一步開展工作場所職業(yè)接觸限值提供參考。同時提示科研、生產(chǎn)人員接觸CL-20應(yīng)加強防護，避免職業(yè)危害。而本次試驗未對CL-20的致突變機制進行探討，今后可開展相關(guān)機制研究，為對其安全防護工作提供一定理論支持。

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作者簡介：

趙彬（1990- ），女，河南焦作人，碩士，助理工程師，研究方向：毒理學(xué)。