多肉植物姬秋麗組培快繁技術研究

王德信 石浩 王少祥 羅偉沼 魏玉鍵 李浩 楊曉瑩 梁宏玲

【摘要】以姬秋麗的葉片和莖尖為外植體材料，進行多肉植物組培快繁技術研究。研究結果表明：以莖尖為外植體培養效果最佳，先用75%乙醇處理30s，再用0.1%升汞浸泡12 - 15min為最佳消毒處理方法;以MS為基本培養基，添加不同濃度6-BA、NAA、KT等植物生長調節劑，適宜誘導姬秋麗愈傷組織及叢生芽的培養基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.Omg/L，效果明顯;叢生芽增殖培養基MS+6-BA 2mg/L+KT l.Omg/L+NAA 0.2mg/L最為適宜;生根培養基以1/2MS+IBA 2.0mg/L為最佳，試驗證明最終成苗率可達90%以上，根部粗壯生長狀態良好，研究表明姬秋麗組織培養快繁技術體系增殖數高，易成活，質量高。

【關鍵詞】姬秋麗;組織培養;快繁體系

【中圖分類號】S682.33

【文獻標識碼】A

姬秋麗（ Graptopetalum mendazoe）是景天科風車草屬多肉植物，姬秋麗是一種雜交的品種，名字是由日本傳過來的。姬秋麗為迷你型多肉植株，植株叢生，多分枝，呈蓮座葉盤狀。葉子橢圓形，葉片較小，一般小于2cm，葉上分布著或多或少的細微紅點。單株直徑3cm左右，葉子顏色呈綠色或黃綠色，但強光環境下呈紅色或橘紅色，姬秋麗春季開花，花小巧玲瓏。枝莖比較短，看上去比較緊湊。

姬秋麗具有非常高的觀賞價值，是近幾年在國內多肉市場流行的品種之一，但是姬秋麗生產主要由葉插繁殖并且繁殖速度慢，生產周期慢，而且病毒不斷積累，進而影響品質，嚴重影響姬秋麗的口碑。本研究主要通過對6-BA、NAA、KT、IBA等植物生長調節劑適合濃度篩選探索姬秋麗叢生芽誘導、增殖、生根繁殖等關鍵環節的影響因素，利用組織培養技術快速繁殖生產多肉植物，提高多肉植物的品質和產量，增加收入。本研究通過對多肉植物姬秋麗組織培養體系的探索，為姬秋麗快速繁殖提供組培技術，同時加快姬秋麗的工廠化生產進程。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

以生長狀況良好的姬秋麗為研究材料，選取生長狀況良好的葉片和莖尖為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理。（1）將姬秋麗葉片用自來水沖洗干凈，用紗布分別將姬秋麗葉片和莖尖包裹住，將紗布綁定在水龍頭上，固定好，打開水龍頭沖洗20 - 30min，調整位置保證沖洗均勻。

（2）沖洗完后，從水龍頭取下紗布，取準備好的表面洗滌劑（洗衣粉或者洗潔精）適量放入lOOOml燒杯中，加自來水用玻璃棒攪拌混勻，混勻后將紗布中的姬秋麗葉片和莖尖輕輕放人燒杯。玻璃棒攪拌后，靜置30min充分去污。

（3）取出姬秋麗葉片和莖尖，用紗布清洗葉片和莖尖表面，清洗的過程中一定要全面，細細輕柔搓洗，洗凈之后再用自來水沖洗姬秋麗葉片和莖尖20 - 30min。

（4）取出外植體材料用75%的酒精浸泡30 - 60s。

（5）倒人0.1%的升汞（HgC12）浸泡10 - 15min。

（6）無菌水沖洗4-5次。

1.2.2無菌室及超凈臺滅菌。先對無菌室進行滅菌，然后用酒精棉球擦拭超凈臺，打開超凈臺紫外線燈，預先20min，殺菌消毒，打開排氣扇，防止細菌進入，保持一個無菌的環境。

1.2.3 無菌操作。將處理的姬秋麗葉片、莖和莖尖放人超凈工作臺內，先用濃度為75%的酒精滅菌30 - 60s，要輕微震蕩切勿搖出。再用無菌水沖洗2-3次，每次10s - 20s，然后用0.1%升汞（ HgC12）滲透內部滅菌，輕輕搖晃10in，最后用無菌水沖洗3-5次。滅菌后的葉片切成0.5cm×0.5cm的方塊，莖和莖尖切成0.5cm莖段，分別接種于預先滅菌的培養基上培養。

1.3 培養條件

試驗在NLS基本培養基基礎上添加6g/L的瓊脂和30g/L的蔗糖，pH值調節至5.8 - 6.0，121℃高壓滅菌鍋中滅菌20min，常溫后添加激素（激素已抽濾滅菌）備用。培養室溫度控制在25℃，光照強度20001x，光周期為16h光照，6h黑暗。

1.4誘導培養

在MS基本培養基基礎上分別添加不同濃度的6-BA、NAA和KT激素，設置三種激素水平（見表1），利用不同外植體和最合適滅菌方法，將外植體接種于各種培養基上，采用L。（ 34）正交試驗設計（見表2），每種處理接種5瓶，每瓶接種4個外植體，3次生物學重復，30 - 45d統計誘導情況。

1.5 增殖培養

在MS基本培養基基礎上分別添加不同濃度的6-BA、NAA和KT激素，設置不同激素水平（見表3），將初代培養中誘導得到的叢生芽或愈傷組織接種于以MS為基本培養基，分別附加不同含量NAA、6- BA、KT的培養基中進行增殖培養，采用k（ 34）正交試驗設計（見表4），每個處理5瓶，每瓶接種1株，重復3次，30d后統計增殖情況。

1.6生根培養與移栽

無菌條件下，將增殖后的叢生芽分離出單芽，分別接種于生根培養基上進行生根培養，生根培養基以1/2MS作為基本培養基，在此基礎上添加不同濃度的IBA（1、2、3mg/L），同時添加15g/L的活性炭，培養30d后統計組培苗的成長情況。當植株長至約4cm時進行煉苗移裁，以泥炭、蛭石、珍珠巖復配材料為煉苗基質，按照3：1：1比例混勻，121℃高壓蒸汽滅菌消毒后使用。打開瓶口煉苗，10d后用鑷子將小苗取出，清除附著在根部的培養基，移栽于基質中，30d后統計組培苗的生長情況。

2 結果與分析

2.1 外植體滅菌條件的篩選

試驗中分別用75%酒精、2%次氯酸鈉及0.1%升汞分別對姬秋麗多肉植物的不同外植體進行滅菌時間條件摸索（見表5），結果表明：利用75%酒精和2%次氯酸鈉滅菌材料，無論是葉片還是莖，污染率較高，最高的可以達到96.3%，最低污染率67%。說明Naao不適合多肉植物姬秋麗外植體的的滅菌。然而利用75%酒精和1%升汞滅菌材料，污染率較低，最低的僅有6.7%，說明多肉植物組培中，外植體滅菌選用75%酒精和o.1%升汞滅菌最為適合;研究還表明隨著HgC12滅菌時間延長，污染率逐步下降，使用HgCI2對最外植體表面進行消毒，滅菌效果更好。葉片消毒時間不宜過長，一般不超過15min為宜，時間過長，會導致后續培養生長緩慢，時間太短，污染率偏高。

2.2 愈傷組織及叢生芽分化誘導分析

不同激素配比的培養基均能成功誘導姬秋麗形成愈傷組織（見表6），誘導率最高可達到85%，大多數能夠誘導分化出叢生芽，少部分愈傷組織繼代培養之后褐化死亡。以姬秋麗的葉為外植體，當培養基為MS+6-BA（2.0 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）時，誘導形成叢生芽的誘導率為76.7%，愈傷組織結構緊密，呈淡黃綠色，叢生芽數量多，整齊度高。研究結果表明適宜誘導姬秋麗愈傷組織及叢生芽的培養基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L。

2.3 不同激素濃度配比對叢生芽增殖的影響

通過誘導長出叢生芽之后就轉接到增殖培養基上進行增殖培養，叢生芽增殖結果見表7。結果表明，叢生芽增殖培養的9種激素配比培養基均有較理想的增殖效果，增殖系數集中在5-9之間，隨著6-BA濃度增加，增殖效果也稍好。其中MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 1.0 mg/L取得最佳增殖培養效果，在培養30d以后，大部分叢生芽的基部均可連續分化出5 - 10個單芽，經過45d之后，即可呈現出團簇狀叢生，而后叢生芽逐漸變為深綠色。

2.4 不同IBA濃度對生根的影響

待姬秋麗無菌培養長出增殖叢生芽之后，分離出單芽轉移到生根培養基上，在1/2MS基本培養基基礎上添加3種不同濃度的IBA及1.5g/L的活性炭，結果表明：1/2MS+IBA 2.0mg/L+活性炭1.5g/L的培養條件最為適宜，生根數量多，效果好，IBA植物生長調節劑對于姬秋麗生根誘導有促進作用。

3 討論

多肉植物繁殖速度慢，利用組培快繁技術能夠快速獲得大量組培苗。多肉植物由于肉質多汁液，外植體的消毒需要徹底，否則污染率較高，本實驗結果中利用洗衣粉浸泡30min后用75%乙醇和0.1%升汞配合消毒技術，取得較好結果，污染率控制在7%左右。在虹之玉、姬朧月、玉露、佛手等多種多肉植物外植體滅菌中進行了嘗試，均取得了良好的效果，證明該方法非常有效。

外植體選擇上，發現莖尖誘導率明顯高于莖和葉片，而且多數莖尖誘導不經過愈傷組織即可生長出芽和苗，成苗率好，相對葉片和莖誘導率高，有的葉片誘導愈傷組織時能夠很快誘導生根。

本系統中篩選出來的愈傷組織及叢生芽誘導培養基，在虹之玉、姬朧月、玉露、佛手等多肉植物快繁中進行試驗，發現在虹之玉和姬朧月組培中取得較好效果，但是需要培養基中的激素濃度微調，玉露、佛手等多肉植物中效果不理想，說明不同多肉植物組培條件不完全一致，需要根據多肉植物自身特點，采用不同增殖方法。本研究初步建立了姬秋麗等多肉植物的組織培養的最佳外植體及各培養階段的最佳培養基配方，結果表明愈傷組織具有高誘導率及成苗率，為姬秋麗的工廠化育苗提供了技術支撐。

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[作者簡介]王德信（1975-），男，山東聊城人，博士，副教授，研究方向：組織培養技術，植物基因表達調控及功能。