致病性海洋弧菌對氨基糖苷類藥物的耐藥傳遞機制初步研究

王瑞旋, 王江勇, 李韻萍, 郭子晗, 李 炳, 李 云, 朱 慧

致病性海洋弧菌對氨基糖苷類藥物的耐藥傳遞機制初步研究

王瑞旋1, 王江勇2, 李韻萍3, 郭子晗4, 李 炳2, 李 云1, 朱 慧1

(1. 韓山師范學院, 廣東 潮州 521041; 2. 中國水產科學研究院南海水產研究所, 廣東 廣州 510300; 3. 華南師范大學, 廣東 廣州 510631; 4. 加尼福利亞浸會大學, 美國 加利福尼亞 92504)

隨著抗菌藥物在水產養殖中用量的增加及混合使用現象的出現, 水產病原菌表現出更強的耐藥性甚至是多重耐藥性, 大大增加了水產養殖中細菌性病害防治的難度。細菌耐藥性最常見的傳遞方式是耐藥質粒的轉移。本研究通過對多個水產致病弧菌質粒上新霉素及卡那霉素的耐藥基因(′)進行檢測分析, 并利用電穿孔法將篩選得到的3個受試菌株上的質粒分別轉入大腸桿菌中, 結果從3個轉化子中檢測到目的基因。進一步的藥敏測試結果顯示, 3個轉化子的最小抑菌濃度(MIC值)以及最小殺菌濃度(MBC值)均明顯上升。可見, 在特定條件下, 水生致病性弧菌對氨基糖苷類(新霉素和卡那霉素)的耐藥質粒可轉移至大腸桿菌并參與介導其耐藥性, 大大降低了受體菌對新霉素和卡那霉素的敏感性。本研究將為環境弧菌與臨床細菌對氨基糖苷類藥物的抗性傳遞研究提供數據基礎和參考依據。

致病弧菌; 耐藥質粒; 新霉素; 卡那霉素; 耐藥機制

隨著水產養殖業的不斷發展, 病害問題愈演愈烈。其中, 弧菌病作為最早被發現且危害最嚴重的水生傳染性疾病之一, 已日漸成為人們關注的焦點。迄今為止, 已發現的病原弧菌有哈維弧菌、溶珊瑚弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、燦爛弧菌、殺鮭弧菌、創傷弧菌等。其中, 在海水養殖病害事件中, 哈維弧菌已成為出現頻率最高的致病菌之一[1-2], 或以病原的身份存在, 或扮演“幫兇”角色引起海水動物包括魚、蝦、貝類的感染[3-9], 給養殖戶帶來了嚴重的經濟損失, 同時也是人類的條件致病菌[10], 其中有大約5%的哈維弧菌可同時引起人類感染發病[11]。溶珊瑚弧菌是海水中的正常菌群之一, 其數量居于海洋弧菌之首, 它廣泛分布于世界各地海水及河口處, 同時還大量分布于多種海洋動物中, 是多種海水養殖動物的條件致病菌。塔氏弧菌也是典型的條件致病菌, 廣泛分布于養殖環境中, 可引起牡蠣、象拔蚌、蛤蜊等軟體動物甚至珊瑚等暴發疾病[12-14], 如Hasegawa等發現塔氏弧菌可使太平洋牡蠣幼蟲致死[15], 而Séré等則發現西印度洋中珊瑚所患的白斑綜合征由塔氏弧菌所導致[16]。目前抗菌藥物治療仍是防治水產養殖動物細菌性病害的主要措施。而養殖生產實踐中, 漁藥的使用存在亂用、濫用等現象[17], 藥物殘留及藥物的選擇壓力致使細菌基因突變或耐藥基因轉移從而產生耐藥性, 最終導致抗菌藥物的治療效果減弱甚至無效[18], 抗生素的不科學使用正是導致耐藥性的主要原因[19]。菌株的耐藥性不僅能通過基因水平傳播, 還能在相同或不同種屬的細菌之間傳播, 從而增加了水產養殖魚類細菌性病害的防治難度, 并可能使得水產養殖魚類細菌性病害面臨藥物治療無效的結果。細菌的耐藥性不僅對水產養殖戶造成經濟損失, 而且對人類健康造成嚴重的威脅。研究表明, 水產養殖動物細菌有將耐藥性傳遞給人類細菌的可能性, 耐藥質粒的傳遞作用使得水產養殖魚類病原菌與大腸桿菌可相互傳遞耐藥質粒, 威脅著人類健康[20]。此外, 食源性病原菌耐藥同樣威脅著人類健康, 且已有研究表明水產品中食源性致病菌廣泛存在耐藥現象[21]。

目前有28種以上抗菌藥物被允許使用于水產養殖中, 幾乎囊括了所有抗菌素類藥物。作為廣譜抗生素, 氨基糖苷類抗菌藥物除了應用于人類疾病的治療, 還常被應用于家畜和水產養殖業。隨著應用的增多, 水生細菌對這類藥物也產生了廣泛的耐藥性。有研究表明, 來源于河口水體、沉積物或養殖魚類的水生弧菌對慶大霉素和鏈霉素等氨基糖苷類藥物表現耐藥性[22]。水生細菌耐藥現象已不容忽視, 由于水環境中微生物的復雜性及水流的動力, 更利于細菌之間的接觸從而使其更易于互相傳遞耐藥性。耐藥質粒的水平轉移是自然界中細菌產生耐藥性最主要、最常見的方式, 由耐藥質粒介導的耐藥性正朝著多重耐藥方向發展。本文通過對致病弧菌的氨基糖苷類耐藥基因進行檢測和分析, 并將相關質粒轉入大腸桿菌中使其對氨基糖苷類藥物的敏感性大大降低, 本研究將為環境弧菌與臨床細菌對氨基糖苷類藥物的抗性傳遞研究提供數據基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

菌株來源: 7株受試菌由中國水產科學研究院南海水產研究所漁病室分離保存, 均為革蘭氏陰性菌, 具體如下: 編號BBX1: 致使方斑東風螺患“腫吻癥”而急性死亡的哈維弧菌[23-24], 編號BV2和9H7: 均是引起鮑膿皰癥的哈維弧菌[8]; 編號B2D: 引起鮑肌肉萎縮癥的哈維弧菌[25]; 編號BBXP1: 使方斑東風螺死亡的塔氏弧菌; 編號NA0301: 使雜色鮑鮑苗大規模脫落死亡的溶珊瑚弧菌[26]; 編號TO1: 引起卵形鯧鲹結節病的美人魚發光桿菌殺魚亞種subsp.[27]; 受體菌株: 大腸桿菌ATCC25922。同時以大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923為質控菌株。

培養基: 水解酪蛋白(Mueller-Hinton, 簡稱MH)瓊脂培養基、MH液體培養基、營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖(Thiosulfate citrate bile salts sucrose, 簡稱TCBS)瓊脂培養基、細菌基礎培養基(Luria-Bertani, 簡稱LB)液體培養基(購自環凱生物科技有限公司)。

抗生素紙片: 青霉素(10 U/片)、呋喃唑酮(300 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、紅霉素(15 μg/片)、四環素(30 μg/片)、多西環素(30 μg/片)、利福平(5 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、恩諾沙星(10 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、氯霉素(30 μg/片)、復方新諾明(10 μg/片)均購自北京天壇藥物生物技術開發公司; 卡那霉素藥粉、新霉素藥粉均購自廣州威佳科技有限公司。

試劑盒及PCR試劑及引物: 高純質粒 DNA微量提取試劑盒(離心柱法)、細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱法)和DNA純化試劑盒(離心柱法)(購自廣州吉瑞基因科技有限公司), 6×buffer、PCRmix、ddH2O和Marker(購自寶生物工程有限公司)。

1.2 藥敏測試

以實驗室保存的受試菌為研究對象, 采用紙片擴散法(Kirby-Bauer, 簡稱K-B法), 根據CLSI標準及相關文獻進行操作[28-29]。用無菌生理鹽水洗脫于斜面培養基上于28℃培養24 h的菌苔, 稀釋至菌懸液濃度約為1×108CFU/mL, 吸取100 μL菌懸液均勻涂布在MH瓊脂培養基上(培養皿直徑9 cm, 培養基厚度約4 mm), 涂布后在室溫下放置15~30 min, 待菌液被吸收, 用無菌鑷子夾取抗生素紙片貼在培養基表面, 每個平板放置5張藥敏紙片, 紙片與培養皿邊界距離>1.0 cm, 相鄰紙片距離≥2.0 cm, 然后將平板在28℃生化培養箱中倒置培養24 h, 測量抑菌圈直徑, 根據表1和表2判斷不同菌株對不同抗菌藥物的敏感程度: 敏感(S)、中度耐藥(I)、耐藥(R)。

1.3 耐藥基因的檢測

挑取活化的受試菌單菌落分別接種于含有2% NaCl的35 mL營養肉湯培養基中, 28℃搖床培養過夜, 分別按照高純質粒DNA微量提取試劑盒和細菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟進行操作, 分別獲得質粒DNA和基因組DNA, 進一步回收DNA后用純化試劑盒進行純化。根據GENBANK中′的堿基序列進行耐藥基因擴增引物的設計, 并采用聚合酶鏈式反應法對耐藥基因進行擴增。引物序列見表3, PCR反應體系見表4。PCR反應條件為: 94℃預變性2 min, 94℃變性50 s, 60℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 35個循環, 72℃保持5 min, 4℃保存。

表1 非苛養細菌標準菌株紙片擴散法抗微生物藥物敏感性實驗抑菌環直徑質控允許范圍

表2 藥敏實驗判定標準

表3 耐藥基因擴增引物及相關信息

表4 PCR反應體系

1.4 耐藥質粒的電擊轉化

將大腸桿菌標準株的新鮮菌落接種于10 mL的 LB培養基中, 搖床200 r/min、37℃培養過夜。按照1︰20的比例, 將過夜培養菌液轉接于100 mL的LB液體中, 搖床200 r/min、37℃培養3~5小時, 至OD600吸光值為0.5~0.8, 將菌液放置于冰上冷卻10 min。將冷卻后的菌液于4℃轉速5 000×離心10 min, 棄上清, 用35 mL預冷的ddH2O重懸細菌沉淀。將細菌懸液于4℃轉速5 000×離心10 min, 棄上清, 用35 mL預冷的甘油重懸細菌沉淀。將細菌懸液于4℃轉速5 000×離心10 min, 棄上清, 加入1 mL 10%甘油, 用1.5 mL離心管分裝成100 μL/管, 由此獲得大腸桿菌感受態細胞, 置于–80℃保存備用。將0.4 mL電擊杯放于冰上預冷, 凍存的感受態細胞于冰上凍融。在冰上將5 μL質粒(4 ng/μL)加入到30 μL感受態細胞中, 并在冰上培育5 min。將質粒與感受態細胞的混合液加入到預冷的電擊杯中, 去除電擊杯中的氣泡, 冰浴10 min。擦干電擊杯外壁上的水, 電擊。電擊條件: 2.5 kV, 200Ω, 25 μF。聽到蜂鳴聲后迅速將1 mL 37℃保溫的LB培養基加入到電擊杯中(1 min之內), 并在無菌操作臺中將混合液轉移到1.5 mL EP管中(室溫進行)。將混合液于220 r/min搖床37℃培養2 h, 吸取100 μL轉化液均勻涂布在加入新霉素的營養瓊脂平板上(新霉素濃度: 10 ng/mL, 室溫放置待液體吸收后, 在37 ℃生化培養箱中倒置培養24 h后觀察菌落生長狀況。

重組質粒的鑒定: 挑取轉化平板上的單菌落接種到35 mL含有新霉素的營養肉湯培養基中, 37℃搖床培養過夜。取1~7 mL菌懸液于2 mL EP管中, 10 000×離心1 min, 收集菌體沉淀。使用高純質粒DNA微量提取試劑盒獲得質粒DNA并保存于–20℃備用。利用聚合酶鏈式反應對重組質粒新霉素耐藥基因′進行擴增以鑒定, 反應體系同表5。

表5 特異片段(677 bp)檢出結果對比

1.5 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定

以新霉素對大腸桿菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, 簡稱MIC)和最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration, 簡稱 MBC)為對照組, 分別測定新霉素對三株受試菌(BBX1、BBXP1、NA0301)的MIC值和MBC值, 設平行組。方法如下: 取無菌2 mL EP管13支排成一排, 依次編號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。向每支EP管中加入1 mL MHA液體培養基, 在1號管中加入濃度為256 μg/mL新霉素1 mL混勻, 然后吸取1 mL勻液至2號管中, 混勻后再吸取1 mL勻液l至3號管中, 以此類推, 連續倍比稀釋至11號管, 且從11號管吸取1 mL勻液棄去。12號管為不含新霉素的生長對照管, 13號管為陰性對照管。此時, 1—11號管的藥物濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。然后在1—12號管加入濃度約為107CFU/mL的菌液10 μL, 使各管最終菌液濃度約 105~106CFU/mL。將各管放置在200 r/min搖床37 ℃培養24 h后觀察結果。測定卡那霉素對受試菌的MIC的方法同上。然后, 取出肉眼觀察到無細菌生長最低3個濃度(包括MIC)的EP管, 用移液槍吹打EP管中的培養液使其混勻, 并吸取100 μL培養液均勻涂布在MH瓊脂平板上, 在常溫下放置5~10 min待培養液被培養基完全吸收, 將平板在37 ℃下恒溫倒置培養24 h, 對平板進行菌落計數, 并與對照組比較, 以與對照組平板菌落數差異顯著的藥物梯度濃度判定為受試藥物對相應測試菌株的MIC值, 以無菌生長對應的藥物梯度濃度判定為受試藥物對相應測試菌株的MBC值。

2 結果分析

2.1 水產致病性弧菌的耐藥率及質粒檢測結果

根據表2的藥敏實驗判定標準, 對7株受試菌針對8類共14種抗菌藥物的敏感性進行判斷, 7株受試菌均表現耐藥(如圖1), 其中編號B2D的菌株對受試的14種藥物均表現為耐藥(即對受試藥物耐藥比例為100%), 7株受試菌均對3類以上抗生素表現耐藥, 多重耐藥率為100%; 且7個菌株均對受試的氨基糖苷類藥物(包括慶大霉素、新霉素和卡那霉素)表現中度耐藥和完全耐藥。

圖1 水產致病菌藥物耐藥率分析

將藥敏實驗所篩選得到的耐藥菌通過質粒提取試劑盒的處理, 分析質粒攜帶情況(如圖2)結果發現, 7株受試菌均攜帶質粒, 質粒攜帶率為100%, 每株受試菌攜帶質粒大小約為1 kb, 均為小型質粒。

圖2 耐藥菌質粒電泳圖

注: 1: TO1, 2: BBXP1, 3: BBX1, 4: NA0301, 5: BV2, 6: B2D, 7: 9H7, 8: DNA Marker(10 000 bp)

用ddH2O代替質粒DNA作為陰性對照, 以質粒DNA和基因組DNA作為模板, 對氨基糖苷類耐藥基因′進行PCR擴增。質粒DNA耐藥基因擴增結果如圖 3所示, 受試菌BBX1、BBXP1、NA0301、9H7均分別擴增出677 bp的特異性片段且無其他雜帶出現。以相應菌株的基因組DNA為模板進行耐藥基因的擴增, 如圖4所示, 上述4株菌中的BBX1、BBXP1和NA0301未擴增出耐藥基因片段。677 bp的耐藥基因在受試菌的質粒DNA及基因組DNA檢出結果如表5所示。

圖3 質粒DNA耐藥基因aph(3′)-Ⅱa PCR產物電泳結果

注: 1: DNA Marker (2 000 bp), 2: BBX1, 3: BBXP1, 4: TO1, 5: NA0301, 6: BV2, 7: B2D, 8: 9H7, 9: 空白對照)

對在質粒DNA上檢測出特異片段同時在相應基因組DNA上未檢出特異片段的3株受試菌(BBX1、BBXP1和NA0301)進行耐藥基因測序, 用DNAstar MegAlign軟件對耐藥基因測序結果進行分析, 結果表明BBX1、BBXP1、NA0301中的′耐藥基因與GenBank中的序列(登錄號: AY222814)同源性分別為99.1%、99.5%、99.5%, 表明引物特異性較高, 所擴增到的片段為′基因(圖4), 提示受試菌′耐藥基因位于質粒DNA上, 參與介導受試菌對新霉素的抗性。

圖4 基因組DNA耐藥基因aph(3′)-Ⅱa PCR產物電泳結果

注: 1: DNA Marker (2 000 bp), 2: BBX1, 3: BBXP1, 4: TO1,5: NA0301, 6: BV2, 7: B2D, 8: 9H7, 9: 空白對照

2.2 重組質粒的鑒定

將3株受試菌的耐藥質粒用電轉化法分別轉移進受體菌大腸桿菌中, 形成轉化子。以弧菌質粒DNA為模板作為陽性對照, 以大腸桿菌質粒DNA為模板作為陰性對照, 以ddH2O代替質粒DNA作為空白對照, 以轉化子(分別命名為BBX1-大腸、BBXP1-大腸、NA0301-大腸)的質粒DNA 作為模板, 對氨基糖苷類耐藥基因′進行PCR擴增。擴增結果如圖5所示, 3株轉化子均擴增出677 bp的特異性片段。通過DNAstar MegAlign軟件對耐藥基因測序結果進行分析, 結果表明轉化子BBX1-大腸、BBXP1-大腸、NA0301-大腸中的′耐藥基因與GenBank中的序列(登錄號: AY222814)同源性分別為95.5%、99.2%、99.2%, 可表明擴增到的片段為′基因。而以大腸桿菌標準株質粒DNA為模板的陰性對照未擴增出特異性片段(如圖5), 說明受體菌大腸桿菌標準株不含有耐藥基因′,即 3株受試菌中的耐藥質粒成功轉移到受體菌大腸桿菌標準株中。

圖5 耐藥質粒電轉產物電泳結果

注: 1: DNA Marker(2 000 bp), 2: BBX1, 3: BBXP1, 4: NA0301, 5: BBX1-大腸, 6: BBXP1-大腸, 7: NA0301-大腸, 8: 大腸桿菌標準株, 9: 空白對照

2.3 肉湯稀釋法測定MIC及MBC

用肉湯稀釋法測定MIC及MBC, 結果如圖6所示, 新霉素對大腸桿菌標準株及轉化子(BBX1-大腸, BBXP1-大腸, NA0301-大腸)的MIC分別為2 ng/μL、4 ng/μL、4 ng/μL、4 ng/μL, 新霉素對大腸桿菌標準株及轉化子(BBX1-大腸, BBXP1-大腸, NA0301-大腸)的MBC分別為4 ng/μL、16 ng/μL、6±2 ng/μL、8 ng/μL; 卡那霉素對大腸桿菌標準株及其轉化子(BBX1-大腸, BBXP1-大腸, NA0301-大腸)的MIC分別為8 ng/μL、16 ng/μL和32 ng/μL、16 ng/μL, 卡那霉素對大腸桿菌標準株及轉化子(BBX1-大腸, BBXP1-大腸, NA0301-大腸)的MBC分別為16 ng/μL、32 ng/μL、32 ng/μL、32 ng/μL。結果顯示, 新霉素和卡那霉素對大腸桿菌標準株的MIC及MBC均低于3株轉化子對相應抗菌藥物的MIC及MBC。大腸桿菌標準株和3株轉化子對新霉素抗性的差異表明3株受試菌中的耐藥質粒成功轉移到大腸桿菌標準株中, 且介導大腸桿菌標準株對新霉素及卡那霉素的耐藥機制, 使大腸桿菌標準株對新霉素及卡那霉素的敏感性降低。

圖6 大腸桿菌電轉前后對新霉素和卡那霉素抗性的對比

3 討論

海水養殖環境源的弧菌群的耐藥狀況不容忽視, 部分地區海水弧菌對單種藥物的耐藥率最高達到90%以上[30], 部分養殖貝類中弧菌的多重耐藥率高達70%以上[29]。眾所周知, 海洋弧菌屬于條件致病菌, 廣泛存在于水環境中及養殖動物體內。有研究表明弧菌基因組上隱藏著隨時可被插入耐藥基因片段的整合子[31], 加上水體環境非常利于微生物之間的接觸, 更利于菌群間互相交換傳遞耐藥因子[32], 從而使弧菌更易表現多重耐藥性。而致病菌的耐藥性傳播和擴散不僅嚴重影響多種藥物在獸醫臨床的治療效果, 且耐藥菌群很可能借助動物宿主通過食物鏈、環境或直接接觸等與人類臨床病原菌進行傳遞, 特別是人畜/人魚共患致病菌的耐藥性, 更給人類醫療帶來壓力[33]。本研究中來源于重要養殖貝類的7株弧菌均表現多重耐藥, 4株弧菌對6類及以上抗菌藥物耐藥, 1株弧菌對8類共14種抗菌藥物耐藥, 多重耐藥率為100%。

耐藥質粒的轉移不僅使得耐藥菌的數量在世界范圍急劇增加, 更介導著耐藥菌往多重耐藥方面發展。已有研究表明僅通過混合培養即可將耐藥質粒從大腸桿菌向水生病原弧菌轉移, 且可使四環素對受體弧菌的MIC值大大提高[34]。本研究中仍以大腸桿菌標準株為受體菌, 以質粒上攜帶氨基糖苷類耐藥基因′的哈維弧菌、溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌為供體菌, 采用電擊轉化的方法實現耐藥質粒的轉移, 所測得轉化子的MIC值和MBC值均提高了2~4倍, 顯示3株轉化子對新霉素及卡那霉素敏感性均低于大腸桿菌對相應抗菌藥物的敏感性, 且在轉化子質粒上檢測到了目的片段, 表明3株供體菌的耐藥質粒成功轉移到受體菌中, 且質粒參與介導受體菌對新霉素和卡那霉素的抗性。然而, 轉化子并未到達完全耐藥的表型。可能由于受試菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥性除了耐藥質粒介導之外, 還存在其他耐藥機制的共同作用。另一方面, 也可能是對受體菌做電轉化后, 未進行持續的誘導實驗, 使得耐藥質粒上的耐藥基因未能對作用底物(抗菌藥物)產生修飾作用, 抗菌藥物仍能與細菌細胞中16S rRNA上的A位點相結合, 從而抑制細菌蛋白的合成,使細菌對抗菌藥物仍存在一定敏感性, 可通過基因敲除、耐藥質粒消除等手段進行進一步的驗證。本研究中雖以電擊轉化方式進行實驗以縮短反應時間, 而筆者也曾通過混合培養方法(接合反應)將鮑病原哈維弧菌的耐質粒轉入大腸桿菌中, 使受體菌由初始對磺胺類藥物高度敏感轉變為完全耐藥, 并獲得對應耐藥質粒的全序列(全長10 940 bp)[35], 提示水產養殖病原菌耐藥株攜帶的耐藥基因向大腸桿菌傳遞的過程中, 轉化方式不受限制。而已有報道在對志賀菌屬細菌質粒的研究中發現了多重耐藥的廣宿主接合質粒, 該質粒可介導大腸桿菌與志賀菌屬細菌之間耐藥性的水平傳遞, 且具有頭孢類及單環內酰類的耐藥基因[36]。相關研究表明能傳遞耐藥基因的質粒中, 存在能夠在不同種類的細菌之間傳遞的廣宿主接合質粒[37-38]。值得關注的是, 大腸桿菌常被作為模式菌株, 與弧菌的生長條件差異較大, 但二者之間可通過質粒傳遞耐藥性, 該結果提示環境菌群很可能在特定條件下將自身的耐藥性傳遞至臨床菌種, 甚至包括部分人類病原菌。近年來, 氨基糖苷類藥物尤其是新霉素和卡那霉素被世界衛生組織認為是臨床極其重要的藥物[39]。筆者在前期的耐藥分析中發現了水產養殖病原菌對新霉素和卡那霉素存在較強的耐藥性(7個受試株均存在不同程度的耐藥性), 而氨基糖苷磷酸酶基因′主要抑制卡那霉素和新霉素的活性, 雖然APH (′)-IIa的主要氨基糖苷底物是卡那霉素和新霉素, 但這種磷酸轉移酶在體外也能滅活阿米卡星, 即使其轉化速度較慢[40], 依然存在耐藥傳播風險。以往的研究表明,′最初被認為是轉座子Tn5的組成部分[41], 由于Tn5不攜帶傳遞功能信息, 因此通常遵循垂直遺傳模式[40],后期的研究認為氨基糖苷類修飾基因具有通過水平轉移進行傳播的潛力[43]。然而, 國內外對這種磷酸轉移酶相關重要基因′的研究很不足, 國內相關報道甚少, 仍有很多問題未明晰。本研究不僅明確了′基因存在于受試水生病原弧菌的質粒上并參與介導菌株對新霉素和卡那霉素的耐藥性, 且首次確認了特定條件下(如通過電擊轉化)該基因可由水產病原菌傳遞至大腸桿菌, 因此, 本研究結果可為耐藥菌中耐藥質粒的消除提供依據, 為預防水生環境病原菌與臨床病原菌株之間耐藥性的傳遞機制研究提供參考。

4 結論

本研究通過對多個水產致病弧菌(包括引起方斑東風螺、鮑發病的哈維弧菌、塔氏弧菌、溶珊瑚弧菌及卵形鯧鲹結節病病原美人魚發光桿菌殺魚亞種)質粒上新霉素和卡那霉素對應耐藥基因′進行檢測分析, 并利用電穿孔法將篩選得到的哈維弧菌、塔氏弧菌和溶珊瑚弧菌3個受試病原菌株上的質粒分別轉入大腸桿菌標準株中, 進一步的藥敏測試結果顯示, 3株轉化子對新霉素及卡那霉素敏感性均明顯低于受試大腸桿菌標準株對相應抗菌藥物的敏感性(轉化子的MIC值和MBC值均提高了2~4倍),且在轉化子質粒上檢測到了目的片段。本研究明確了′基因存在于受試水生病原弧菌的質粒上并參與介導菌株對新霉素和卡那霉素的耐藥性, 且首次確認了特定條件下該基因可由水產病原菌傳遞至大腸桿菌。

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Primary research on the transmission mechanism of resistance to aminoglycoside for pathogenic marinestrains

WANG Rui-xuan1, WANG Jiang-yong2, LI Yun-ping3, GUO Zi-han4, LI Bing2, LI Yun1, ZHU Hui1

(1. Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China; 2. South China Sea Fisheries Research Institute, Guangzhou 510300, China; 3. South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 4. California Baptist University, California 92504, USA)

The growing number of antimicrobial agents in aquaculture and the development of multi-antibiotics use have led to significant antibiotic-resistances and multi-resistance, which has increased the prevention and control of bacterial diseases in aquaculture. The most effective way for bacteria to spread antibiotic resistance is through the transfer of resistant plasmids. In the present study, theaminoglycoside-resistant gene located on plasmid DNA was amplified by polymerase chain reaction and then three resistant plasmids were sequenced and transformed intoby electroporation. It has been shown that the target gene sequence of three mutants was detected. The result of resistance analysis suggested that the minimal inhibitory concentration (MIC) and the minimal bactericidal concentration (MBC) of three transformants were all much higher than the MIC and the MBC of standard strain. It suggested that drug-resistant plasmids in vibrio spp. could be transferred to, and the resistant plasmid had participated in the resistance mechanism to control the resistance of strains to aminoglycosides, such as neomycin and kanamycin. This study will provide important data and be a reference for the study on the transmission of resistance to aminoglycoside between environmental vibrios and clinical bacteria.

pathogenic vibrio; antibiotic-resistant plasmid; neomycin; kanamycin; drug resistance mechanism

Dec. 21, 2019

Q931

A

1000-3096(2020)10-0081-10

10.11759/hykx20191221002

2019-12-21;

2020-03-01

廣東省自然科學基金項目(2017A030313112); 國家自然科學基金項目(31902416); 廣東省現代農業產業技術體系崗位專家(粵財農[2019]73號); 國家貝類產業技術體系崗位專家(CARS-49); 廣東省教育廳特色創新科研項目(2016KTSCX086)

[Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2017A030313112; National Natural Science Foundation of China, No. 31902416; Modern Agricultural Industry Technical System Post Expert of Guangdong, Province, No. 2019-73; National Shellfish Industry Technical System Position Expert, No. CARS-49; the Innovative Scientific Research Project of Education Department of Guangdong Province, No. 2016KTSCX086]

王瑞旋(1979- ), 女, 廣東揭陽市人, 副研究員, 博士, 主要從事海洋細菌耐藥性研究, E-mail: wangruixuan@scsfri.ac.cn; 朱慧, 男,通信作者, 教授, 主要研究方向: 生理生態學, E-mail: gdzhuhui@126.com

(本文編輯: 楊 悅)