樟樹葉木脂素和多酚超聲輔助同步提取工藝優化

周海旭 謝美玉高 晗李 波蘇同超李忠海

(1. 河南科技學院食品學院，河南 新鄉 453003；2. 中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

樟樹系樟科樟屬植物，主要分布于中國的長江流域及南部區域[1]。樟樹是中國經濟價值較高的、優良的綠化樹種，具有四季常青、滯留煙塵、凈化空氣、美化環境等優點，可用于園林綠化建設[2]。除了作為綠化樹種，樟樹還是極為珍貴的藥用材料和軍用工業材料[3]。現代醫學研究[1]表明，樟樹具有抑菌、殺蟲、抗癌等多種功效。根據現有的文獻[4-6]報道，樟樹中含有多種活性小分子物質。目前學者們[7-8]已經成功從樟樹葉中獲得多酚類物質和木脂素類物質。其中多酚類物質主要指類黃酮、酚酸、木酚素；木脂素類物質主要是指芝麻素、細辛脂素等。它們具有多種生物活性，例如抗癌、抗氧化和抑菌等[9-11]，但是目前樟樹落葉一般歸為垃圾處理，不僅污染環境，還造成了資源的浪費[12]。

對于木脂素和多酚的提取方法主要有溶劑提取法、微波輔助技術、超聲波輔助技術、超臨界技術、亞臨界技術。姜少娟等[13]利用超聲波輔助技術從香樟葉中提取總黃酮，最優條件下黃酮提取率為42.35%；張峰[14]采用響應面法優化超聲波輔助酶解提取樟樹去油枝葉中總多酚，最優條件下總多酚提取率均值為22.08 mg/g；袁列江等[15]利用熱回流工藝從樟樹葉中提取木脂素類物質，最優提取條件下，樟樹葉木脂素的提取率最大為(43.39±4.91) mg/g。

目前國內外研究[16-19]主要集中于對樟樹葉木脂素和多酚單獨的提取方面，未見對兩者同步提取的相關研究。研究擬將超聲波技術的提取時間短、提取率高的優點應用于同步提取樟樹葉中木脂素及多酚類物質，利用超聲波技術造成的“空洞”現象[20-22]破壞樟樹葉細胞壁，改善木脂素及多酚的選擇性從而增加兩者的得率。旨在為樟樹葉的進一步開發利用提供相關的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟樹葉：2018年9月采自中南林業科技大學校內，清洗曬干后粉碎以備用；

無水乙醇、變色酸、濃硫酸、焦性沒食子酸：分析級，中國醫藥集團總公司；

五味子酯甲標準品：質量分數≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

電子天平：GR-202型，上海浦春計量儀器有限公司；

搖擺式中藥粉碎機：DFY-500型，溫嶺市大機械有限公司；

循環水式旋轉蒸發儀：SHB-Ⅲ型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS26型，上海一恒科學儀器有限公司；

超聲波細胞粉碎機：JY92-11型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度儀：UV1800型，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 焦性沒食子酸標準曲線的繪制 參照文獻[23]。

1.2.2 五味子酯甲標準曲線的繪制 參照文獻[24]。

1.2.3 多酚及木脂素得率的計算

(1) 多酚得率：按式(1)計算。

(1)

式中：

Y1——多酚得率，mg/g；

m11——多酚粗品中多酚的質量，mg；

m12——樣品質量，g。

(2) 木脂素得率：按式(2)計算。

(2)

式中：

Y2——木脂素得率，mg/g；

m21——粗品中木脂素的質量，mg；

m22——樣品質量，g。

(3) 總得率：按式(3)計算。

Y=Y1+Y2，

(3)

式中：

Y——總得率，mg/g；

Y1——多酚得率，mg/g；

Y2——木脂素得率，mg/g。

1.2.4 單因素試驗設計

(1) 料液比對樟樹葉多酚及木脂素得率的影響：準確稱取一定質量干燥的樟樹葉粉末。以超聲波功率300 W，超聲時間20 min，乙醇體積分數90%為固定條件，考察料液比(m樟樹葉∶V乙醇)分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)時對多酚和木脂素得率的影響。

(2) 超聲時間對樟樹葉多酚及木脂素得率的影響：準確稱取一定質量干燥的樟樹葉粉末。分別以超聲波功率300 W，乙醇體積分數90%，最優料液比為固定條件，考察超聲時間分別為2，3，4，6，8，10 min時對樟樹葉多酚和木脂素得率的影響。

(3) 乙醇體積分數對樟樹葉多酚及木脂素得率的影響：準確稱取一定質量干燥的樟樹葉粉末。超聲波功率300 W，最優料液比和超聲提取時間為固定條件，考察乙醇體積分數分別為50%，60%，70%，80%，90%，100%時對多酚和木脂素得率的影響。

(4) 提取時間對樟樹葉多酚及木脂素得率的影響：準確稱取一定質量干燥的樟樹葉粉末。以超聲波功率300 W，最優料液比、超聲提取時間和乙醇體積分數為固定條件，考察提取時間分別為40，60，80，100，120 min 時對多酚和木脂素得率的影響。

1.2.5 響應面分析設計 根據單因素試驗結果，采用Design-Expert 8.0.5軟件中的中心組合試驗設計原理進行響應面試驗設計，確定超聲波輔助提取樟樹葉木脂素、多酚的最佳工藝條件。

1.3 數據統計分析

所有試驗均進行3次。試驗數據以Excel進行統計分析，并通過Origin 8.0作圖；響應面試驗通過Design expert 8進行試驗設計和數據統計分析。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

各因素對樟樹葉中木脂素和多酚得率的影響如圖1所示。由圖1可知，最佳的料液比(m樟樹葉∶V乙醇)為1∶20 (g/mL)；最佳的超聲時間為4.0 min；最佳的乙醇體積分數為80%；最佳的提取時間為80 min。

2.2 響應面法優化分析

2.2.1 試驗因素及水平 根據單因素試驗結果，以樟樹葉木脂素、多酚的總得率為響應值，分別考察料液比、超聲時間、乙醇體積分數、提取時間4個因素對總得率的影響。采用Box-Behnken Design中心組合試驗設計原理進行響應面試驗，試驗因素及水平取值見表1，結果見表2、3。

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗 通過Design-Expert 8.0.5軟件對表3中的試驗結果進行多項擬合回歸，得到二次多項回歸方程：

Y=44.48+1.52A-1.02B+0.036C-1.60D+1.37AB-0.87AC-3.18AD+1.05BC-0.73BD-2.30CD-2.97A2-4.94B2-5.01C2-3.26D2。

(4)

圖1 單因素試驗結果

表1 樟樹葉木脂素試驗設計因素與水平

對所得的回歸擬合方程(4)中的變量分別求一階偏導數，得到一組二元一次方程組，以得到提取樟樹葉木脂素、樟樹葉多酚的最佳料液比、超聲時間、乙醇體積分數和提取時間[26]。在此基礎上對方程組進行求解，最終得到提取樟樹葉木脂素和多酚總得率的最優條件為料液比(m樟樹葉∶V乙醇)1∶22 (g/mL)，超聲時間3 min，乙醇體積分數80%，提取時間78 min，在該條件下總得率的理論最大值達到93.14 mg/g。

為了檢驗試驗結果的可靠性和穩定性，在此最優條件下進行5次平行實驗分別測定樟葉木脂素得率、多酚得率、總得率。經測定木脂素得率為44.89 mg/g；多酚得率為48.17 mg/g；總得率為93.06 mg/g，相對誤差為0.09%。結果表明超聲波輔助同步提取樟樹葉木脂素和多酚工藝條件可行。

2.3 超聲波輔助法與微波輔助法提取效果比較

目前已有研究進行了微波法輔助提取樟樹葉中木脂素[16]和多酚類物質[17]，現將其與超聲波輔助法進行比較，結果如表4所示。

由表4可知，超聲波輔助提取技術比微波輔助提取技術效果好。這是因為兩者的作用機理不同：超聲波輔助法主要是利用超聲的空化效應、熱效應以及機械效應來破壞樟樹葉的細胞結構進行提取；微波主要利用分子間的氫鍵斷裂和分子間的碰撞以及破壞細胞膜進行提取[27]。

表2 Box-Benhnken試驗設方案及結果

表3 木脂素得率的ANOVA分析結果?

圖2 各因素間交互作用對總得率影響的曲面圖

表4 超聲波輔助同步提取和微波輔助提取樟葉木脂素和多酚的比較?

3 結論

研究利用超聲波輔助同步提取樟樹落葉中的木脂素及多酚，使用響應面法優化及分析，最終確定最佳值為料液比(m樟樹葉∶V乙醇)1∶22 (g/mL)，超聲時間3 min，乙醇體積分數80%，提取時間78 min，在此條件下木脂素和多酚得率預測值分別為44.89，48.17 mg/g。超聲波輔助同步提取樟葉木脂素和多酚法具有提取溶劑少，提取效率高、可以有效降低單個活性的提取成本的特點；同時木脂素、多酚的提取使得樟樹葉變費為寶，利于環境的保護，降低環境污染。