基于響應面法的馬比木中喜樹堿提取工藝的優化

林勁草，肖 莉，吳酬飛，張紹勇，楊惠寧，張立欽,

（1. 浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300；2. 湖州師范學院 生命科學學院，浙江 湖州313000；3. 湖州師范學院 浙江省媒介生物學與病原控制重點實驗室，浙江 湖州 313000）

喜樹堿(camptothecin, CPT)是一種細胞毒性喹啉類生物堿，1966年由WALL等[1]首次從喜樹Camptotheca acuminata中分離得到。作為植物源農藥的喜樹堿是一種昆蟲不育劑[2]，并且對昆蟲有觸殺和胃毒的作用[3]；對黃瓜白粉病Sphaerotheca fuliginea、番茄灰霉病Botrytis cinerea等也有較好的防治效果[4]。因此，喜樹堿在農業病蟲害防治方面有較大的應用開發潛力。馬比木Nothapodytes pittosporoides是茶茱萸科Icacinaceae假柴龍樹屬Nothapodytes灌木，又名海桐馬比木、公黃珠子、追風傘[5]。主產于貴州、湖南、湖北、四川等地，入藥能除濕、祛風、理氣，主治濕痹、浮腫、疝氣[6?7]。在馬比木植株中，其根、莖、枝、葉、果實和種子中都含有喜樹堿[8?10]。隨著市場對喜樹堿需求量不斷增加，馬比木作為喜樹堿藥源, 具有原料成本低的優點，是國家二級保護植物喜樹的最佳替代品，已成為提取喜樹堿的重要原料[11?13]。目前國內關于馬比木中喜樹堿提取工藝的研究較少，且基本采用的均為正交設計優化。本研究以馬比木為原料，以喜樹堿提取率作為優化指標，采用Box-Behnken響應面法對喜樹堿的提取工藝進行了研究，以期為喜樹堿提取工藝的優化提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗儀器 高效液相色譜儀 (型號 1260，Agilent)；高速多功能粉碎機 (800Y-304，旭曼)；超聲波清洗器(DS-080S，工作頻率40 kHz，東森)；電子分析天平(ME204E，METTLER TLLEDO)。

1.1.2 實驗材料 馬比木 (購于貴州中藥材市場, 主要為枝和葉)，曬干后粉碎過 60 目篩。

1.1.3 實驗試劑 甲醇 (上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析純)；甲醇 (北京百靈威科技有限公司，色譜純)；乙腈(北京百靈威科技有限公司，色譜純)；水為超純水；喜樹堿對照樣品(純度≥98%，合肥博美有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照樣品溶液制備 稱取喜樹堿標準樣品 10.50 mg，置于容量瓶中，甲醇溶解稀釋、定容至50 mL，配制質量濃度為0.21 g·L?1的喜樹堿對照樣品溶液，搖勻，備用。

1.2.2 樣品溶液制備 稱取粉碎后馬比木粉末 5.06 g，置于錐形瓶中，加入甲醇 100 mL，室溫下超聲30 min，0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液備用。

1.2.3 色譜條件 色譜柱 Alltima C18(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流動相為乙腈∶水=25∶75(V∶V)；流速1.0 mL·min?1；檢測波長 254 nm；柱溫 30 ℃；進樣量 20 μL。

1.2.4 標準曲線繪制 取對照樣品溶液 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容至10 mL，按照1.2.3色譜條件進行檢測。以喜樹堿質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 馬比木中喜樹堿提取率測定 稱取粉碎后的馬比木粉末 10.16 g，置于錐形瓶中，加入甲醇 100 mL，溫度條件30 ℃，超聲30 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液按照1.2.3色譜條件進行檢測。根據以下公式計算喜樹堿提取率(R1)：R1=CV/1 000M×100%。其中：C表示提取液中喜樹堿質量濃度(g·L?1)，V表示溶劑體積(mL)，M表示藥材質量(g)。

1.2.6 單因素試驗設計 稱取粉碎后馬比木粉末10 g，置于錐形瓶中，將3個實驗因素：甲醇體積分數、超聲時間、液料比中2個固定不變，1個作為變量進行單因素試驗，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液在1.2.3色譜條件進行檢測，平行3次，取平均值。

1.2.7 Box-Behnken 設計優化提取條件 在單因素實驗基礎上，選擇超聲時間 30 min、甲醇體積分數80% 和 液 料 比 20 mL·g?1(溶 劑 體 積 ∶藥 材 質量=100∶5)3個因素進行優化實驗。以喜樹堿提取率為指標，采用Box-Behnken設計優化提取條件。因素水平如表1所示。

1.2.8 數據 處理及 分析 響應 面實驗 數 據采用Designer-Expert 8.0軟件進行處理，并對數據進行差異顯著性分析。

表 1 因素水平表Table 1 Factors and levels

2 結果與討論

2.1 標準曲線繪制

為準確測量馬比木中喜樹堿的質量濃度，建立高效液相色譜法，以喜樹堿質量濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，計算得線性回歸方程為：y=9×106x+902 381，相關系數R2=0.999 2，喜樹堿質量濃度的線性范圍為 0.021～0.189 g·L?1。

2.2 單因素實驗結果果

2.2.1 甲醇體積分數對喜樹堿提取率的影響 在超聲時間為 30 min，液料比為 20 mL·g?1時，選取甲醇體積分數為50%、60%、70%、80%、90%的條件下進行提取。由圖1A可知：隨著甲醇體積分數的增大，喜樹堿的提取率先增大后減小。當甲醇體積分數超過80%時，提取率開始減小。提高甲醇體積分數有利于喜樹堿的提取，當甲醇體積分數＞80%時，喜樹堿提取率反而降低，可能由于隨甲醇體積分數的提高，提取液極性減小，其中某些雜質的溶出增加，干擾了馬比木的檢測，提取率下降。當甲醇體積分數為80%時，提取率達最大值，因此選擇甲醇體積分數為80%為宜。

2.2.2 超聲時間對喜樹堿提取率的影響 在甲醇體積分數為 80%，液料比為 20 mL·g?1時，選取超聲時間分別為10、20、30、40和50 min的條件下進行提取。由圖1B可知：隨超聲時間的增加，喜樹堿提取率先增加后減小，在超聲時間為30 min時喜樹堿提取率最高。這是因為隨超聲時間增加，喜樹堿發生氧化的概率也會增大，使提取率降低，所以選擇提取時間為30 min適宜。

2.2.3 液料比對喜堿提取率的影響 在超聲時間為30 min，甲醇體積分數為 80% 時，選取液料比分別為12、16、20、24和28 mL·g?1的條件進行提取。由圖1C可知：隨著液料比由小到大，喜樹堿提取率先增加后減小，提取率最高的液料比為20 mL·g?1。隨著溶劑的增多，馬比木與溶劑之間能充分接觸，有利于馬比木溶解于溶劑中，當液料比超過20 mL·g?1后，已經達到飽和狀態，再加就稀釋了，喜樹堿提取率下降，所以選擇液料比20 mL·g?1較適宜。

圖 1 不同影響因素下喜樹堿提取率的變化Figure 1 Change of the extraction rate of camptothecin under different influencing factors

2.3 響應面優化實驗結果

依據單因素實驗結果，初步選定甲醇體積分數80%、超聲時間30 min和液料比20 mL·g?1為最佳提取條件，采用Box-Behnken響應面法對其進行優化，結果如表2所示。

以喜樹堿提取率為指標(R1)，采用Designer-Expert 8.0軟件進行二次多項式回歸擬合，得到方程：R1=0.11?8.500×10?3A+6.125×10?3B+4.375×10?3C+7.000×10?3AB?0.014AC+0.015BC?0.026A2?0.024B2?0.030C2。其中：A表示甲醇體積分數，B表示超聲時間，C表示液料比。多元回歸模型的方差分析見表3。由ANVOA分析可知：在考察指標的二項式方程中，模型的F為24.59(P=0.000 2＜0.001)，說明回歸模型極顯著；擬合相關系數R2=0.969 3，調整系數R2Adj=0.929 9，失擬項顯著(P=0.034 3＜0.05)。該模型擬合程度較好，實驗誤差較小；信噪比較高，為12.503＞4.000，說明該多元回歸模型可預測馬比木中喜樹堿的最優提取工藝條件。

顯著性檢驗結果表明：甲醇體積分數(A)、超聲時間(B)、液料比(C)對馬比木中喜樹堿提取率的影響順序依次為A、B、C。甲醇體積分數的二次項A2、超聲時間的二次項B2、液料比的二次項C2對馬比木中喜樹堿的提取率有極顯著影響(P＜0.001)；超聲時間和液料比的交互項BC對馬比木中喜樹堿的提取率有極顯著影響(P＜0.01)；甲醇體積分數A與甲醇體積分數和液料比的交互項AC對馬比木中喜樹堿的提取率有顯著影響(P＜0.05)；超聲時間B、液料比C、甲醇體積分數與超聲時間的交互項AB對馬比木中喜樹堿提取率的影響不顯著(P＞0.05)。

表 2 Box-Behnken 設計實驗和結果Table 2 Box-Behnken Design tests and results

表 3 響應面回歸模型 ANOVA 分析結果Table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

相對于3個單因素的其中2個因素，采用Box-Behnken繪制三維響應面圖，兩兩因素的交互作用對馬比木中喜樹堿提取率的影響見圖2。由圖2A可見：甲醇體積分數A的曲面較陡峭，超聲時間B的曲面較平緩，說明甲醇體積分數對馬比木中喜樹堿提取率的影響比超聲時間的影響大。由圖2B可見：甲醇體積分數A的曲面較為陡峭，液料比C的曲面較為平緩，說明甲醇體積分數對馬比木中喜樹堿提取率的影響比液料比大。由圖2C可見：超聲時間B的曲面較陡，液料比C的曲面較為平緩，表明超聲時間對馬比木中喜樹堿提取率的影響比液料比的影響大。可見，在選擇的3個單因素中，甲醇體積分數A對馬比木中喜樹堿的提取率的影響顯著，表現為其曲線較陡；在兩兩因素交互作用中，甲醇體積分數與液料比的交互作用(AC)對馬比木中喜樹堿的提取率影響顯著，超聲時間與液料比的交互作用(BC)對馬比木中喜樹堿的提取率影響顯著。

2.4 最優方案驗證

根據模型預測，得到馬比木中喜樹堿提取的最優工藝為：甲醇體積分數46.4%，超聲時間26.1 min，液料比21.20 mL·g?1。在此條件下進行3次平行實驗，測得喜樹堿提取率分別為0.080 4%、0.082 6%、0.082 1%，與模型預測值接近，平均誤差3.2%，表明模型能較好地預測喜樹堿實際提取率。

圖 2 不同影響因素對喜樹堿提取率影響的響應面圖Figure 2 Response surface diagram of the effect of different influencing factors on camptothecin extraction rate

3 結論

本研究以馬比木為原料，以喜樹堿提取率作為優化指標，在單因素實驗基礎上，選取甲醇體積分數、超聲時間和液料比3個因素，通過Box-Behnken響應面法對17組實驗進行分析，在整個區域得到回歸方程，可以直觀反映出各個因素對喜樹堿提取率的影響。優化的最優工藝為：甲醇體積分數46.4%，超聲時間 26.1 min，液料比 21.20 mL·g?1，喜樹堿提取率為 0.084 4%。3 次驗證實驗結果顯示：提取率平均誤差3.2%。說明本次建立的擬合模型較為成功，可以為馬比木中喜樹堿的提取應用提供一定的參考。