偏最小二乘方法在不同白酒香型判別分析中的應(yīng)用

魏泉增，范江濤，劉嘉玲，宋麗君，李 瑞，謝玉鋒

（1.許昌學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 許昌 461000；2.河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，河南 許昌 461000；3.哈爾濱學(xué)院 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086）

傳統(tǒng)的白酒香型鑒別方法主要依靠品酒師憑借感官品評(píng)。醬香型、濃香型、清香型是我國主要的三大香型白酒，由于生產(chǎn)地域不同，使得不同產(chǎn)地的白酒具有風(fēng)味成分眾多、香氣成分復(fù)雜的特點(diǎn)，給香型的辨別分析帶來困難。但近年來，隨著分析技術(shù)的發(fā)展，對(duì)白酒香味成分進(jìn)行了深入研究[1-6]。范文來等[7]對(duì)洋河酒廠的藍(lán)色經(jīng)典系列白酒進(jìn)行分析，結(jié)果表明在濃香型白酒中認(rèn)為重要的化合物如乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸等化合物并不是洋河藍(lán)色經(jīng)典系列白酒的重要香氣成分[8]。孫細(xì)珍等[9]采用保留指數(shù)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)法分別從現(xiàn)代工藝和傳統(tǒng)工藝小曲清香型白酒中鑒定出116種和121種揮發(fā)性成分，并通過化合物遺漏實(shí)驗(yàn)尋找到了清香型白酒重要的風(fēng)味物質(zhì)。陳華明等[10]采用氣相色譜法對(duì)醬香型白酒中63種風(fēng)味組分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合嗅閾值計(jì)算各樣品中風(fēng)味組分的香氣活性值（odor active values，OAVs），確定29種主要風(fēng)味組分進(jìn)行主成分分析，確定醬香型白酒的主要香氣成分。目前采氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）方法[11-13]對(duì)白酒香氣成分進(jìn)行分析，所獲得的數(shù)據(jù)量較多[14]，數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性高，處理起來相當(dāng)困難，同種香型的白酒也存在明顯差異[15]。偏最小二乘回歸（partial least square，PLS）是近年來應(yīng)用實(shí)際需要而產(chǎn)生和發(fā)展的一個(gè)具有廣泛使用性的新型多元統(tǒng)計(jì)分析方法，是多元線性回歸、主成分分析和典型相關(guān)分析的有機(jī)結(jié)合[16]。PLS能有效地解決樣本量少、自變量較多、相關(guān)性較高的數(shù)據(jù)模型，近年來在食品行業(yè)領(lǐng)域受到了極大的重視及應(yīng)用[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)用氣相色譜技術(shù)測(cè)定不同香型白酒，將所獲得的信息轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣，采用PLS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模分析，以期建立一種白酒香型分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒（7個(gè)品牌，分別編號(hào)為NX1、NX2、NX3、NX4、NX5、NX6、NX7）每個(gè)品牌3個(gè)樣品，醬香型白酒（8個(gè)品牌，分別編號(hào)為JX1、JX2、JX3、JX4、JX5、JX6、JX7、JX8）每個(gè)品牌3個(gè)樣品，清香型白酒（7個(gè)品牌，分別編號(hào)為QX1、QX2、QX3、QX4、QX5、QX6、QX7）每個(gè)品牌3個(gè)樣品：市售。

1.1.2 試劑

甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙縮醛、甲醇、丁酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、乙酸丁酯、異丁醇、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、己酸乙酯、正戊醇、庚酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、β-苯乙醇、乳酸乙酯、正己醇、辛酸乙酯、十六酸乙酯、乙酸正戊酯、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、2-乙基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫7890A氣相色譜儀（配有DB-WAX毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID））：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

內(nèi)標(biāo)溶液配制：分別吸取200 μL乙酸正戊酯，200 μL 2-乙基丁酸，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容至10 mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別吸取甲酸乙酯、乙縮醛、甲醇、丁酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、乙酸丁酯、異丁醇、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、正丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、正戊醇、庚酸乙酯、正己醇、辛酸乙酯、乙酸、丙酸、壬酸乙酯、丁酸、癸酸乙酯、異戊酸、戊酸、己酸、β-苯乙醇、庚酸、辛酸、十六酸乙酯40 μL，分別吸取乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯200 μL，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇定容至10 mL作為母液。分別吸取母液5 mL、1 mL、200 μL、80 μL，用體積比為60%乙醇定容至10 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL，為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 色譜條件

起始溫度為40℃維持10min，3℃/min升至70℃，4 ℃/min升至180 ℃，15 ℃/min升至210 ℃，維持5 min。進(jìn)樣口溫度200.0 ℃；隔墊吹掃流量30 mL/min。分流比20∶1。檢測(cè)器溫度230.0 ℃；空氣流量400 mL/min，氫氣流量3 mL/min。流動(dòng)相為氮?dú)猓魉? mL/min。

1.3.3 工作曲線的制作及檢出限的測(cè)定

不同濃度混標(biāo)由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以信噪比（S/N）=3，計(jì)算檢出限（limitofdetection，LOD）。

1.3.4 精密度試驗(yàn)

測(cè)定NX7酒樣中不同物質(zhì)的含量，平行測(cè)定3次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)品加入法對(duì)NX7酒樣做3個(gè)水平加標(biāo)回收試驗(yàn)（各做3次平行），測(cè)定回收率。

1.3.6 白酒樣品測(cè)定

白酒樣品過0.45μm水相濾膜，定容到10 mL，加入0.1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，采用氣相色譜測(cè)定白酒成分。進(jìn)樣量：1 μL。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

以白酒樣品為醬香型白酒賦值為0，為濃香型賦值為1，為清香型賦值為2，設(shè)定為因變量[16]。以香氣成分的含量設(shè)定為自變量。選取樣本的16%為驗(yàn)證集，84%為訓(xùn)練集，先將訓(xùn)練集導(dǎo)入SIMCAP-14.1軟件中進(jìn)行PLS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖1 32種香氣成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of 32 kinds of mixed standards of aroma substance

由圖1可知，除3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇的分離度為0.9，其余相鄰兩種物質(zhì)的分離度均大于1.5。因此，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中32種標(biāo)準(zhǔn)品與2種內(nèi)標(biāo)的分離效果較好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 定量關(guān)系及檢出限

以信噪比為3為檢測(cè)限濃度，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，建立線性方程。相關(guān)系數(shù)R2、檢出限各組分的相關(guān)系數(shù)R2在0.999 01～0.999 99，R2均＞0.999，檢出限范圍分別為0.17～7.50 mg/L。說明在一定濃度范圍內(nèi)，32種香氣成分的線性關(guān)系良好。

2.3 精密度

采用氣相色譜對(duì)某濃香型白酒的香氣成分進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，各成分測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）＜6%，表明該方法精密度較高，該方法能夠滿足白酒中香氣成分的定量要求。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision tests

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

香氣物質(zhì)加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，NX7酒樣中香味物質(zhì)加標(biāo)回收率結(jié)果的RSD在0.18%～3.63%，表明具有良好的重復(fù)性，回收率也均在80.20%～97.93%。可見該方法回收率高，可用于檢測(cè)白酒中香味物質(zhì)的含量。

表2 香氣物質(zhì)加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery rates of aroma compounds

續(xù)表

續(xù)表

2.5 樣品香氣成分測(cè)定

濃香型白酒中己酸乙酯的含量在813.19～1370.53mg/L，乙酸乙酯的含量在596.00～955.46 mg/L，乳酸乙酯的含量在316.55～792.97 mg/L。醬香型白酒中己酸乙酯19.38～87.47mg/L，乙酸乙酯1.19～2641.87mg/mL，乳酸乙酯624.46～1 798.68 mg/L。清香型白酒中己酸乙酯0～3.54 mg/L，乙酸乙酯在340.46～1389.06mg/L，乳酸乙酯198.67～983.61mg/L。

濃香型白酒中酸類物質(zhì)含量?jī)H次于酯類，其中乙酸350～561.92 mg/L，己酸388.07～554.15 mg/L和丁酸24.17～140.28 mg/mL具有較高的濃度水平。醬香型白酒中乙酸443.01～1 730.89 mg/mL，己酸10.61～48.82 mg/mL，丁酸23.51～96.26 mg/mL。在清香型白酒中乙酸247.39～699.57 mg/mL，己酸4.18～16.17 mg/mL。

高級(jí)醇一般由發(fā)酵過程中氨基酸的降解和葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑的轉(zhuǎn)化而生成[19]。濃香型白酒含量較高有正丙醇（2.28～170.25mg/L）和3-甲基-1-丁醇（2.37～190.22mg/L）。醬香型白酒有正丙醇（178.16～1 428.39 mg/L），3-甲基-1-丁醇（22.33～316.39 mg/L）。清香型白酒中有正丙醇（58.84～167.13 mg/mL），3-甲基-1-丁醇（0～286.10 mg/L）。

2.6 模型判別分析

2.6.1 PLS分析

采用Simac-p14.1軟件中內(nèi)置的留一法（leave-one-out）對(duì)樣本進(jìn)行PLS 分析。PLS模型提取3個(gè)主成分t1、t2和t3。主成分t1自變量特征值貢獻(xiàn)度為29.5%，因變量特征值貢獻(xiàn)度為66.7%；主成分t2自變量特征值貢獻(xiàn)度為12.3%，因變量特征值貢獻(xiàn)度為20.7%；主成分t3自變量特征值貢獻(xiàn)度為17.1%，因變量特征值貢獻(xiàn)度為5.83%。前3個(gè)主成分自變量特征值貢獻(xiàn)度為59.0%，對(duì)因變量特征值貢獻(xiàn)度為93.3%，而3個(gè)主成分所預(yù)測(cè)模型的累計(jì)差異為89.9%。這說明該模型的預(yù)測(cè)精度和效度不錯(cuò)。

訓(xùn)練集所建立的模型中，以第一主成分t1的得分值為橫坐標(biāo)和第二主成分t2的得分值為縱坐標(biāo)繪制得分散點(diǎn)圖2。由圖2可知，不同香型的白酒彼此分開，其中香型相同白酒較集中。所有樣本都落在95%的置信區(qū)間內(nèi)，無異常值。

圖2 訓(xùn)練集得分圖Fig.2 Score plot of the training set

2.6.2 模型驗(yàn)證

采用樣本數(shù)據(jù)的隨機(jī)排列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷PLS模型是否存在過擬合的情況[20]。Y的順序被隨機(jī)地重復(fù)50次。比較訓(xùn)練集模型的擬合優(yōu)度R2與預(yù)測(cè)優(yōu)度Q2。從圖3可以看出，擬合優(yōu)度都大于預(yù)測(cè)優(yōu)度，且擬合優(yōu)度的趨勢(shì)線在縱軸上的截距為0.201，預(yù)測(cè)優(yōu)度的趨勢(shì)線在縱軸上的截距為-0.399。一般認(rèn)為擬合優(yōu)度的趨勢(shì)線在縱軸上的截距＜0.4，預(yù)測(cè)優(yōu)度的趨勢(shì)線在縱軸上的截距＜0.05，則模型不存在過擬合的情況。

圖3 不同白酒香型樣品排列檢驗(yàn)Fig.3 Permutations plot for the different flavor Baijiu

以訓(xùn)練集真實(shí)值為縱坐標(biāo)、估計(jì)值為橫坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖4。由圖4可知，且兩者之間的差異由評(píng)估均方差（root mean square error of estimation，RMSEE）表示。顯示了PLS模型中作為訓(xùn)練集的不同真實(shí)值與估計(jì)值之間的關(guān)系。RMSEE的值為0.217 623，且可以看出不同香型白酒能明顯分開。由于預(yù)測(cè)均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）值與RMSEE值相差不大，說明模型的效果好。為了驗(yàn)證PLS訓(xùn)練集模型，將不同香型白酒的驗(yàn)證集帶入訓(xùn)練集所創(chuàng)建的模型中進(jìn)行驗(yàn)證。預(yù)測(cè)不同白酒的香型，模型能力由驗(yàn)證集產(chǎn)生的RMSEP表示。PLS模型中作為驗(yàn)證集的不同香型白酒的真實(shí)值與估計(jì)值之間的關(guān)系見圖5。由圖5可知，RMSEP 的值為0.245 351，且不同香型白酒被預(yù)測(cè)出來。

圖4 偏最小二乘法分析中訓(xùn)練集中的真實(shí)值與估計(jì)值的關(guān)系Fig.4 Relationship between true value and estimate value of partial least square derived training set

圖5 偏最小二乘法分析中驗(yàn)證集中的真實(shí)值與估計(jì)值的關(guān)系Fig.5 Relationship between true value and estimate value of partial least square derived validation set

3 結(jié)論

為建立一種白酒香型判斷方法，采用氣相色譜分析白酒香氣成分。結(jié)果表明該方法香氣成分線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，檢測(cè)限＜5.11 mg/L，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD＜4.11%；平均回收率為80.20%～97.93%。采用PLS對(duì)不同香型白酒香氣成分分析，建立了預(yù)測(cè)模型，由排列檢驗(yàn)結(jié)果說明模型不存在過擬合現(xiàn)象，通過比較預(yù)測(cè)值與真實(shí)值表明PLS模型具有較好地預(yù)測(cè)能力，由參數(shù)RMSEE和RMSEP值能證明預(yù)測(cè)精度較高，能夠較好的判斷出白酒香型。本研究為白酒香型判別提供一條新的途徑和思路。