菌種強(qiáng)化結(jié)合工藝優(yōu)化提高醬香白酒基酒中四甲基吡嗪含量的研究

盧 君，張 穎，李福榮，唐 平，山其木格，孟天毅，梁青松，張 樂(lè)，馮國(guó)躍，張翠英，肖冬光，李長(zhǎng)文

（1.貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)股份有限公司，貴州 仁懷 564501；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津 300410；3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

近年來(lái)，醬香型白酒以其獨(dú)特的感官風(fēng)味和更為舒適的飲后體征感受，越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞。醬香型白酒的酒體中包含了種類(lèi)更為豐富的風(fēng)味物質(zhì)和生物活性組分[1-4]，如四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP），近年來(lái)受到廣泛的關(guān)注，被認(rèn)為是與醬香風(fēng)格密切相關(guān)的物質(zhì)，同時(shí)也是行業(yè)中公認(rèn)的“健康因子”[5]，具有增加腦血管的血流量，減少腦缺血性疾病的發(fā)作、改善學(xué)習(xí)的障礙[6]、防止由無(wú)水乙醇引起的胃粘膜損傷和腎中毒[7-8]、防止由硫代乙酰胺引起的急性肝中毒[9]、降低腦萎縮的傷害[10]、防止肝纖維化等功效[11]、分解甘油三酯[12]、改善高血糖、抑制α-葡萄糖苷酶活性，同時(shí)具有體外抗炎作用[13]等諸多健康功效。

隨著“健康中國(guó)”發(fā)展戰(zhàn)略的制定和實(shí)施，消費(fèi)者對(duì)于飲酒的態(tài)度越來(lái)越理性，對(duì)于白酒健康層面的需求越來(lái)越強(qiáng)烈。由于醬香型白酒的獨(dú)特工藝特點(diǎn)，健康因子——四甲基吡嗪，仍然是研究的熱點(diǎn)。中國(guó)工程院孫寶國(guó)院士提出“白酒的發(fā)展方向是健康，健康白酒應(yīng)該通過(guò)‘內(nèi)尋外加，自然強(qiáng)化’來(lái)實(shí)現(xiàn)”[14]。在實(shí)際釀酒生產(chǎn)過(guò)程中，從制曲、堆積或發(fā)酵階段篩選出高產(chǎn)四甲基吡嗪的微生物，并應(yīng)用強(qiáng)化到特定的生產(chǎn)發(fā)酵階段，這種方式是常見(jiàn)的高產(chǎn)四甲基吡嗪的手段。王西等[15]將從高溫大曲中篩選得到的產(chǎn)香枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）應(yīng)用到醬香型白酒生產(chǎn)中，結(jié)果顯示堆積組發(fā)酵后的糟醅中四甲基吡嗪相對(duì)含量達(dá)到6.98 μg/g，是空白組的4.56倍；王曉丹等[16]將篩選得到的一株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）強(qiáng)化到粹沙工藝醬香白酒發(fā)酵的酒醅中，發(fā)酵后酒醅中的四甲基吡嗪含量是對(duì)照組的3.03倍。

以往的研究，僅應(yīng)用菌種強(qiáng)化發(fā)酵的單一手段來(lái)提高基酒中的四甲基吡嗪含量。本研究針對(duì)醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)工藝，對(duì)比了3種方法對(duì)醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪的含量的影響，即利用菌種強(qiáng)化的方式，在釀酒發(fā)酵階段，通過(guò)功能微生物代謝提高基酒中四甲基吡嗪的含量；利用工藝優(yōu)化方式，將菌劑加入尾酒中浸提得到高含量四甲基吡嗪的浸提液，在烤酒階段，通過(guò)蒸餾方式（浸提液加入地鍋串蒸）使四甲基吡嗪遷移入基酒中；應(yīng)用菌種強(qiáng)化和工藝優(yōu)化雙管齊下的方法。旨在為進(jìn)一步提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪的含量提供一種新的、可被企業(yè)實(shí)際應(yīng)用的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和曲粉

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）M2（MBJ09001）：分離自茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠高溫大曲，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏編號(hào)為CGMCC 18734。曲粉：貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)五輪次釀酒生產(chǎn)時(shí)期的生產(chǎn)用曲粉。

1.1.2 試劑

小麥：某酒廠提供；四甲基吡嗪（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；2-乙酰基吡啶（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市匯杭化工科技有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）：天津市康科德科技有限公司；甲酸（色譜純）：美國(guó)Fluka公司；甲醇（色譜純）：德國(guó)默克公司；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2-乙基丁酸（色譜純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基[17]：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH=7.5，121 ℃高壓滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉15 g。

1.2 儀器與設(shè)備

BPS-250HC高溫培養(yǎng)箱：上海申騁儀器科技有限公司；Q-Trap 5500三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）儀：美國(guó)AB SCIEX公司；UFLC超高效液相系統(tǒng)：島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；DGG-101-1BS電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LMQ.C-80E立式滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；IT-09A5磁力攪拌器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌劑的制備

菌種活化：從甘油管保存的枯草芽孢桿菌M2中挑取少許菌體，在LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)18 h，長(zhǎng)出單菌落后挑取單菌落再次劃線，以此重復(fù)三次，對(duì)菌株進(jìn)行活化和純化。

一級(jí)種子液：從活化后的枯草芽孢桿菌M2平板挑取少許單菌落菌體接種于LB液體培養(yǎng)基，裝液量15 mL/150 mL，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至生長(zhǎng)穩(wěn)定期。

二級(jí)種子液：將一級(jí)種子液按10%（V/V）的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，裝液量150 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至生長(zhǎng)穩(wěn)定期。

固體菌劑制備：稱(chēng)取麥沙（從酒廠制曲車(chē)間取得，與實(shí)際制曲生產(chǎn)時(shí)粉碎度相同的磨碎的小麥，已加水，但未添加母曲）和麥粉（用粉碎機(jī)粉碎的小麥粉），裝入不銹鋼盆中，每個(gè)不銹鋼盆中麥粉和麥沙按質(zhì)量比1∶1混勻。每盆3 kg原料中加入300 mL二級(jí)種子液（接種量為10%）和750 mL水，最終水分含量為37.1%。不銹鋼盆上覆蓋紗布，放入高溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行固體培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，第1天在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h；第2天將培養(yǎng)溫度調(diào)整至44 ℃，持續(xù)1 d；發(fā)酵第3天將培養(yǎng)溫度調(diào)整至52 ℃，高溫生香保持2 d；以此條件循環(huán)兩次制備得到固體菌劑。發(fā)酵過(guò)程中觀察發(fā)酵情況，每天根據(jù)濕度補(bǔ)水、攪拌、測(cè)量溫度。

1.3.2 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌劑的生產(chǎn)應(yīng)用方式

菌種強(qiáng)化方式[17]：將制備得到的菌劑自然干燥后再進(jìn)行磨粉，應(yīng)用于2019年貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)五輪次基酒的生產(chǎn)中，選取了三車(chē)間9班8號(hào)窖池作為實(shí)驗(yàn)窖池，另選擇該班組其他4個(gè)窖池作為對(duì)照窖池。應(yīng)用功能枯草芽孢桿菌M2制作的固態(tài)菌劑（干燥粉碎后）（共10 kg）強(qiáng)化到醬香型白酒堆積發(fā)酵結(jié)束后、入窖發(fā)酵之前窖池的上層糟醅中，菌劑與普通曲粉的質(zhì)量比為1∶5，跟蹤發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)程，經(jīng)過(guò)一個(gè)輪次的發(fā)酵后（30 d），開(kāi)窖烤取基酒，評(píng)定基酒中四甲基吡嗪的含量和感官質(zhì)量的差異。

工藝優(yōu)化方式：將制備得到的高含量四甲基吡嗪的菌劑，按照1∶10的質(zhì)量比添加到醬香型白酒基酒生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生的頭尾酒中，浸泡7 d，獲得頭尾酒浸提液，再將頭尾酒浸提液替代普通頭尾酒，倒回地鍋，通過(guò)蒸餾烤酒使得浸提液中的四甲基吡嗪遷移至基酒中，評(píng)定基酒中四甲基吡嗪的含量和感官質(zhì)量的差異。

菌種強(qiáng)化結(jié)合工藝優(yōu)化方式：應(yīng)用上述菌種強(qiáng)化和工藝優(yōu)化相結(jié)合的方式，即在釀酒生產(chǎn)階段進(jìn)行菌種強(qiáng)化，在蒸餾烤酒階段進(jìn)行工藝優(yōu)化。在2019年貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)六輪次基酒的生產(chǎn)過(guò)程中，選取了一車(chē)間1班6號(hào)窖池作為實(shí)驗(yàn)窖池，該班組其他窖池均為對(duì)照窖池。評(píng)定基酒中四甲基吡嗪的含量和感官質(zhì)量的差異。

1.3.3 分析檢測(cè)方法

（1）四甲基吡嗪的檢測(cè)方法

曲粉/菌劑樣品前處理：稱(chēng)取2.8 g粉碎后的曲粉/菌劑樣品，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為53%的乙醇溶液，浸泡10 min，25 ℃條件下超聲提取30 min，超聲功率250 W，超聲頻率40 kHz，20 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，稀釋至合適倍數(shù)后過(guò)0.45 μm的有機(jī)濾膜，取過(guò)濾后樣品1 mL于液相樣品瓶中，供液質(zhì)分析。

基酒酒樣前處理：基酒酒樣稀釋至合適倍數(shù)后過(guò)0.45μm的有機(jī)濾膜，取過(guò)濾后樣品1 mL于液相樣品瓶中，供液質(zhì)分析。

采用HPLC-MS檢測(cè)四甲基吡嗪含量，參考以往文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行優(yōu)化[18-21]，液相色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫35 ℃；流動(dòng)相為甲醇：0.1%甲酸=35∶65（V/V）；流速0.4 mL/min；洗脫梯度：0.01～1 min，10%甲醇；1～5 min，35%甲醇。質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式，具體參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 HPLC-MS法測(cè)定四甲基吡嗪多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式條件參數(shù)Table 1 Parameters of multiple reaction monitoring mode for tetramethylpyrazine determined by HPLC-MS

正離子模式下，以四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)匹配，結(jié)合二級(jí)特征碎片離子，實(shí)現(xiàn)定性分析。采用外標(biāo)法進(jìn)行四甲基吡嗪的定量分析。

（2）理化指標(biāo)檢測(cè)方法

菌劑和大曲的酸度測(cè)定采用酸堿滴定法，糖化力采用菲林滴定法，具體檢測(cè)方法參見(jiàn)《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(shū)》[22]。

（3）基酒感官品評(píng)方法[23]

組織4位國(guó)家一級(jí)品酒師，對(duì)本研究中的基酒樣品進(jìn)行感官品評(píng)，分別從曲香、醬香、酒體醇和度、后味、干凈度這5個(gè)維度進(jìn)行打分評(píng)價(jià)（0～9分，0代表感知不到，9代表特征極為明顯）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌劑制備結(jié)果

測(cè)定制備的菌劑和生產(chǎn)用曲粉的酸度、糖化力和四甲基吡嗪含量，并進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，制備的菌劑酸度相比于生產(chǎn)用曲粉酸度更高，推測(cè)其原因是強(qiáng)化菌株枯草芽孢桿菌M2（MBJ09001）的代謝產(chǎn)酸能力更強(qiáng)。菌劑中的四甲基吡嗪的含量（627.15 μg/g）是生產(chǎn)用曲粉的160倍，說(shuō)明應(yīng)用枯草芽孢桿菌M2進(jìn)行發(fā)酵能夠代謝產(chǎn)生高含量的四甲基吡嗪。同時(shí)，制備的菌劑糖化力（20.16 mg/（g·h））很低，但對(duì)于本研究來(lái)說(shuō)并不影響后續(xù)的發(fā)酵階段強(qiáng)化和蒸餾烤酒應(yīng)用的要求。

表2 制備的菌劑與生產(chǎn)用曲粉指標(biāo)差異Table 2 Differences of indexes between prepared microbial agents and Daqu powder for production

2.2 菌種強(qiáng)化方式提高基酒中四甲基吡嗪含量的生產(chǎn)應(yīng)用結(jié)果

不同窖池烤取的基酒中四甲基吡嗪的含量見(jiàn)圖1。由圖1可知，實(shí)驗(yàn)窖池烤取的基酒中四甲基吡嗪含量為16.06 mg/L，比對(duì)照窖池烤取的基酒中四甲基吡嗪的平均含量（6.16 mg/L）提高160.71%，說(shuō)明利用菌種強(qiáng)化的方式能夠大幅提高基酒中四甲基吡嗪的含量，與以往的研究結(jié)果一致[15-17]。

圖1 菌種強(qiáng)化方式提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量結(jié)果Fig.1 Results of improving tetramethylpyrazine content in sauceflavor Baijiu base liquor by strain strengthening

2.3 工藝優(yōu)化方式提高基酒中四甲基吡嗪含量的生產(chǎn)應(yīng)用結(jié)果

醬香型白酒在蒸餾烤酒過(guò)程中會(huì)生產(chǎn)出基酒和尾酒。基酒指的是酒精度為53%vol左右的酒（一輪次基酒57%vol、二輪次基酒54.5%vol、三輪次基酒53.5%、四至五輪次基酒53%vol、六至七輪次基酒52%vol）。在烤酒過(guò)程中，當(dāng)酒精度下降至8%vol～15%vol時(shí)，此時(shí)收集得到的酒稱(chēng)為頭尾酒；酒精度降至5%vol～8%vol時(shí)，此時(shí)收集得到的酒稱(chēng)為二尾酒。為了回收頭尾酒中的酒分子以提高基酒的產(chǎn)量，生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)將上一排的頭尾酒倒入下一排的地鍋中，在蒸餾烤酒過(guò)程中使得頭尾酒中的酒分子串蒸至下一排的基酒中，因此也就增加了基酒的產(chǎn)量，這是醬香型白酒釀造過(guò)程中常見(jiàn)而普遍采用的工藝。根據(jù)這個(gè)工藝特點(diǎn)，嘗試用頭尾酒來(lái)浸泡高含量四甲基吡嗪菌劑的方法，使四甲基吡嗪通過(guò)浸提遷移至頭尾酒中。再利用浸提過(guò)菌劑的尾酒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的尾酒進(jìn)行地鍋串蒸，這樣既回收了酒分子，同時(shí)也有益于四甲基吡嗪通過(guò)串蒸遷移至基酒中，從而提高基酒中四甲基吡嗪的含量。

本研究將高含量四甲基吡嗪的菌劑浸泡在頭尾酒中7 d，四甲基吡嗪浸提效果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著浸泡時(shí)間的增加，尾酒中四甲基吡嗪含量逐漸增加，從最初頭尾酒中僅含有6.70 mg/L增加到第7天時(shí)的66.35 mg/L，說(shuō)明四甲基吡嗪具有較好的醇溶性，利用浸提的方法能夠使得頭尾酒中富集高含量的四甲基吡嗪。

圖2 醬香型白酒頭尾酒提取四甲基吡嗪的效果Fig.2 Effect of tetramethylpyrazine extraction from tail spirit of sauce-flavor Baijiu

將經(jīng)過(guò)7 d浸提菌劑后的頭尾酒代替普通頭尾酒，回地鍋蒸餾，檢測(cè)基酒中的四甲基吡嗪含量，用普通尾酒回地鍋后烤取的基酒作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，工藝優(yōu)化后基酒中四甲基吡嗪的含量為8.60 mg/L，而應(yīng)用傳統(tǒng)工藝烤取的基酒中四甲基吡嗪含量為4.63 mg/L，工藝優(yōu)化后的基酒中四甲基吡嗪的含量提升了85.75%。

圖3 工藝優(yōu)化方式提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量結(jié)果Fig.3 Results of improving tetramethylpyrazine content in sauceflavor Baijiu base liquor by process optimization

2.4 菌種強(qiáng)化結(jié)合工藝優(yōu)化方式提高基酒中四甲基吡嗪含量的生產(chǎn)應(yīng)用結(jié)果

應(yīng)用菌種強(qiáng)化和工藝優(yōu)化雙管齊下的方法進(jìn)一步提升醬香型白酒基酒中的四甲基吡嗪含量。對(duì)同一個(gè)窖池在發(fā)酵階段和蒸餾階段采用上述兩種工藝，以傳統(tǒng)工藝釀造的基酒作為對(duì)照，基酒中四甲基吡嗪的含量見(jiàn)圖4。由圖4可知，實(shí)驗(yàn)窖池對(duì)應(yīng)的基酒中四甲基吡嗪含量達(dá)到了21.98 mg/L，而應(yīng)用傳統(tǒng)工藝對(duì)應(yīng)的基酒中四甲基吡嗪的平均含量為7.26 mg/L，菌種強(qiáng)化結(jié)合工藝優(yōu)化后的基酒中四甲基吡嗪的含量提升了202.75%。

圖4 菌種強(qiáng)化結(jié)合工藝優(yōu)化方式提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量結(jié)果Fig.4 Results of improving tetramethylpyrazine content in sauceflavor Baijiu base liquor by strain strengthening combined with process optimization

對(duì)比應(yīng)用以上3種方法提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于單一采用菌種強(qiáng)化或工藝優(yōu)化，采用菌種強(qiáng)化和工藝優(yōu)化雙管齊下的方法，其效果最好，并且這種方法也適合醬香型白酒釀造企業(yè)的生產(chǎn)實(shí)際，容易被生產(chǎn)應(yīng)用落地；另外，菌種強(qiáng)化的方式的效果要優(yōu)于工藝優(yōu)化的方法，這可能是浸提液在中國(guó)白酒特殊的固態(tài)蒸餾工藝下，遷移至基酒中的效率不高的緣故。

2.5 基酒質(zhì)量對(duì)比結(jié)果

由圖5可知，采用菌種強(qiáng)化工藝優(yōu)化的方法以及二者相結(jié)合的方法對(duì)于基酒的曲香得分均有提高效果，說(shuō)明基酒中的四甲基吡嗪與“曲香”特征存在相關(guān)性。本研究重點(diǎn)關(guān)注采用菌種強(qiáng)化和工藝優(yōu)化相結(jié)合的方法釀制的基酒，其曲香特征和整體風(fēng)格都要略?xún)?yōu)于傳統(tǒng)工藝釀制的對(duì)照基酒；而在干凈度特征上，相對(duì)于對(duì)照基酒則有所降低。這可能是由于頭尾酒不僅提取出了菌劑中的四甲基吡嗪，同時(shí)也提取出了其他醇溶性香氣物質(zhì)，這些香氣物質(zhì)也在串蒸過(guò)程中遷移到了基酒中所致。采用兩種不同工藝釀造出的基酒的整體感官差異不大，經(jīng)過(guò)感官評(píng)定，兩類(lèi)基酒的質(zhì)量等級(jí)均被評(píng)為二級(jí)。所以，本研究認(rèn)為利用菌種強(qiáng)化結(jié)合工藝優(yōu)化這種方法，對(duì)于基酒的曲香和干凈度會(huì)有一定影響，但對(duì)于基酒的整體質(zhì)量影響不大。

圖5 不同工藝釀造的基酒感官得分雷達(dá)圖Fig.5 Radar chart of sensory scores of base liquor brewed by different processes

3 結(jié)論

本研究針對(duì)醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)工藝，創(chuàng)新性的引入了發(fā)酵階段的菌種強(qiáng)化和蒸餾烤酒階段的工藝優(yōu)化的雙管齊下的方法，通過(guò)疊加作用進(jìn)一步提升醬香型白酒基酒中的四甲基吡嗪的含量。結(jié)果表明，單一采用菌種強(qiáng)化的方法能夠?qū)⒒浦兴募谆拎汉刻岣?60.71%；單一采用工藝優(yōu)化的方法能夠?qū)⒒浦兴募谆拎汉刻岣?5.75%；而采用菌種強(qiáng)化和工藝優(yōu)化相結(jié)合的方法能夠?qū)⒒浦兴募谆拎汉刻嵘?02.75%。菌種強(qiáng)化和工藝優(yōu)化相結(jié)合的方法對(duì)于提升基酒中四甲基吡嗪含量的效果最好，且對(duì)基酒質(zhì)量影響不大。該技術(shù)生產(chǎn)操作簡(jiǎn)便，適于企業(yè)落地應(yīng)用。