武宣地區紅曲米對紅曲柿酒品質影響及其細菌組成分析

李慧敏，林 鳳，王玉梅，羅佳沂，李 洋，毛瑞豐

（廣西大學 輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530000）

紅曲米是以稻米為基質在特定生態環境下用成曲作母種培養發酵制成，因其顏色鮮艷也稱為丹曲或者赤曲。紅曲米中含有較多的淀粉酶、糖化酶及酯化酶，在釀酒過程中起到發酵劑作用，常被用于釀制米酒[1]。以紅曲作為發酵劑釀制果酒，可以增強產品色澤，形成獨特風味[2]，但目前將紅曲應用到果酒生產的相關研究較少。柿子中含有豐富的生物活性物質[3]，以柿子為原料經多種工藝釀造而成的柿子酒，具有柿子獨特的顏色和果香味，同時還具有促進人體消化和生津健脾等多種功能，但柿子由于缺少像葡萄、蘋果等常見釀酒果實中所具有的構成果酒品質特性的多種有機酸，對酵母菌的發酵作用不利，并且發酵而成的柿子酒往往風味不佳。將紅曲引入柿酒發酵體系，可使柿酒具有獨特的風味、絢麗的色彩和更高的營養保健價值三種特色，從而克服柿子酒風味欠佳、營養成分不足的缺點，使生產的果酒具有更好的感官風味和營養保健功能。

紅曲米質量的好壞直接決定最終成品酒品質，酒曲富集了曲霉、酵母菌和乳酸菌等多種微生物及其產生的豐富酶系，不同地區的生產環境、制備工藝、氣候條件及地理位置等差異形成了酒曲產品的菌群多樣性。在發酒酵過程中，絲狀真菌可以通過淀粉的糖化作用來產生酸，而酵母可以通過發酵糖類產生，但是它們產生的有機酸含量非常少[4]。一些研究指出細菌在酒發酵產酸過程起到了重要作用，如乳酸菌可通過異源發酵產乳酸、乙酸等有機酸[5]，醋酸桿菌能氧化葡萄糖或乙醇生成乙酸[6]，直接影響成品酒的口感和風味[7]。目前，大部分研究都集中在紅曲各類型酒在發酵過程中微生物群落與風味物質之間的相關性分析[8-9]，還鮮有對紅曲米菌群結構的對比研究。比較紅曲米細菌菌群差異，對深入了解紅曲酒釀造機制具有一定的意義。

本研究使用武宣地區三種紅曲米作為發酵劑釀造紅曲柿酒，對其理化指標和揮發性風味成分進行分析，并應用Illumina MiSeq高通量測序技術分析三種武宣紅曲米細菌多樣性，為了解發酵劑細菌群落結構對成品酒品質影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

WX-1、WX-2、WX-3紅曲米：廣西來賓市武宣縣；恭城月柿：廣西桂林恭城。

1.1.2 試劑

安琪SY釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母有限公司；無水乙醇（分析純）、重鉻酸鉀（分析純）、濃硫酸（純度98%）、氫氧化鈉（分析純）、3,5-二硝基水楊酸（分析純）：南京化學試劑股份有限公司；Qubit3.0脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）檢測試劑盒：美國Life Technologies公司；高純度耐熱DNA聚合酶（8 U/μL）、2×TaqMaster Mix：美國Vazyme公司；QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統：美國Promega公司；MagicPure Size Selection DNA Beads：法國Transgen公司；E.Z.N.A.Soil DNA試劑盒：美國Omega公司。

1.2 儀器與設備

LRH-800F恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；RE-2010旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；UV1800-PC紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；XMT-F9型電熱恒溫水浴鍋：上海洪記儀器設備有限公司；7890A型安捷倫氣相色譜-質譜聯用（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：美國安捷倫科技公司；9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PHBJ-260 pH計：上海雷磁儀器廠；198*30手持折光儀：上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲柿酒釀造工藝[10]

柿子→清洗→脫澀→去果柄和花盤→果漿調配→主發酵→倒酒→后發酵→倒酒→澄清→低溫陳釀→紅曲柿酒原酒

操作要點：

（1）選取完整無病害的恭城脆柿，經過清洗、脫澀、去果柄和花盤后打漿處理。

（2）果漿調配：柿果打漿后，調糖度18%～22%，調pH值為4.5～5.5，按原果漿∶水=4∶1比例稀釋調配。

（3）主發酵：調配好后，加入原料質量0.03%的活化釀酒酵母和3.5%紅曲米粉，發酵8～10 d。

（4）后發酵：主發酵過后，倒酒去除酒腳，進行后發酵15 d。

（5）澄清：后發酵完成后，第二次去除酒腳，加入復合澄清劑（0.02%果膠酶和0.03%可溶性殼聚糖）澄清4～6 d。澄清完畢，過濾除濾渣。

（6）低溫陳釀：待澄清后，進行低溫陳釀。將紅曲柿酒降溫為4 ℃繼續陳釀2個月，使酒更加協調，得到原酒。

1.3.2 紅曲柿酒質量指標測定

理化指標：采用分光光度法測定酒精度[11]；采用酸堿滴定法測定總酸、揮發酸含量[12]；采用手持糖度儀測定可溶性固形物（殘糖量）含量；采用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[13]；采用氧化法測定SO2含量[12]。

微生物指標：參照國標GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》測定細菌菌落總數、大腸菌群；參照國標GB 29921—2013《食品中致病菌限量》測定致病菌。

1.3.3 紅曲柿酒中揮發性成分的測定

采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜法測定紅曲柿酒中的揮發性成分[14]。

GC條件：DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm×0.5 μm），載氣為氦氣（He），流速19 mL/min；進樣口溫度為230 ℃，程序升溫：起始溫度為60 ℃，保持2 min，5 ℃/min升至160 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至230 ℃保持1 min，最后運行31 min。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃，連接桿溫度150 ℃。采用全掃模式收集信號，掃描范圍33～550 m/z。

定性定量：測定結果基于美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）14質譜庫檢索進行定性分析，面積歸一化法進行定量分析，通過匹配度及CAS#號判斷可能的物質種類。

1.3.4 紅曲米細菌菌群高通量測序

分別稱取200mg紅曲米樣品，放入無菌的2mL離心管中，加入1 mL體積分數70%的乙醇，振蕩混勻，10 000 r/min室溫離心3 min，棄上層液體。加入磷酸鹽緩沖液溶液（0.01 mol/L、pH=7.2），振蕩混勻，10 000 r/min室溫離心3 min，棄上層液體。按照Power Soil DNA Isolation Kit說明書分別提取3種紅曲米菌群的宏基因組DNA，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量。以提取的宏基因組DNA為模板，采用引物341F（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）對細菌的16S rRNA V3-V4區序列進行PCR擴增。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共20個循環；72 ℃再延伸5 min。PCR擴增體系（20 μL）：2×Phusion Master Mix 15 μL，正向及反向引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 20 ng，補雙蒸水（dd H2O）至30 μL。PCR擴增產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

利用Min Eluter PCR Purification Kit對PCR擴增產物進行純化。利用Tru-SeqRDNA PCR-Free Sample Preparation Kit制備測序文庫并添加接頭序列，經過Nano Drop 2000測定文庫質量后，利用Illumina MiSeq 2500測序平臺進行高通量測序[13]。

1.3.5 高通量測序數據處理與分析

使用QIIME軟件中的UCLUST將可操作分類單位（opti caltransform unit，OTU）根據97%的相似度進行聚類[15]。根據OTU在不同樣本中的豐度分布，采用QIIME進行alpha多樣性（Chao1、ACE、Shannon指數）分析。

1.3.6 數據處理

每組試驗重復3次，試驗結果以“平均值±標準差”表示，采用R語言3.6.1對數據進行分析，采用Origin8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 不同種紅曲米對紅曲柿酒發酵品質的影響

2.1.1 不同種紅曲米對紅曲柿酒理化指標的影響

3種紅曲柿酒發酵過程中總酸、揮發酸含量及酒精度的變化見圖1。由圖1可知，3種紅曲柿酒中的總酸和揮發酸含量首先迅速上升，發酵4～6 d時到達峰值，而后下降直至趨于平緩。WX-2組紅曲柿酒的總酸和揮發酸含量最高，與其他兩組差異顯著（P＜0.05）。發酵后期總酸和揮發酸含量都呈下降趨勢，是由于酸類物質能與醇類物質反應生成相應的酯類物質，從而賦予酒體香味[16]。由圖1亦可知，紅曲柿酒發酵過程中酒精度與發酵時間呈正相關，且3種紅曲發酵劑對酒精度無顯著影響（P＞0.05）。酒精度的增加一定程度可以抑制酸的生成，因為當酒精度達到一定值，產酸的關鍵細菌可能不再存活，從而可以抑制總酸、揮發酸含量的增加[17]。

圖1 3種紅曲柿酒發酵過程中總酸（a）、揮發酸含量（b）及酒精度（c）的變化Fig.1 Changes in total acid (a),volatile acid content (b) and alcohol content (c) in three kinds of red kojic persimmon wine during fermentation

3種紅曲柿酒發酵過程中還原糖、可溶性固形物及SO2含量的變化見表1。由表1可知，3種紅曲柿酒在可溶性固形、SO2含量上均顯著差異（P＜0.05）。WX-3柿酒樣品的還原糖含量最高，與其他兩組差異顯著（P＜0.05），推測可能與紅曲米中糖化酶糖化速率有關。3種紅曲柿酒理化指標均達到國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求。

表1 3種紅曲柿酒理化指標檢測結果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of three kinds of red kojic persimmon wine

2.1.2 微生物指標

3種紅曲柿酒的微生物指標見表2。由表2可知，3種紅曲米制得的紅曲柿酒中細菌總數均≤50 CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/100 mL，致病菌未檢出，結果表明3種紅曲柿酒微生物指標均符合國標GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》、GB 29921—2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》要求。

表2 3種紅曲柿酒微生物指標檢測結果Table 2 Detection results of microbial indexes in three kinds of red kojic persimmon wine

2.2 紅曲柿酒揮發性成分測定

采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結合GC-MS對發酵8 d后的紅曲柿酒中的主要風味物質進行檢測，其相對含量對比結果見圖2。

圖2 3種紅曲柿酒中揮發性成分相對含量Fig.2 Relative content of volatile components in three kinds of red kojic persimmon wine

使用紅曲發酵柿子酒引入了非果酒風味物質，豐富了發酵制品風味。由圖2可知，3種紅曲米發酵而成的紅曲柿酒中酸類物質差異明顯，相對含量分別為4.2%、3.3%、10.0%，其中揮發性酸類物質的組成及占比見表3。

由表3可知，辛酸、乙酸為果酒中主要的揮發性酸類物質，WX-2紅曲米制成的紅曲柿子酒中含有較多的棕櫚酸。棕櫚酸含量過高具有腐敗脂肪氣味；乙酸具食醋內酸味及刺激性氣味；辛酸少量時有水果香味，大量具有汗臭味。適量的酸類物質能提高酒體的整體協調性，過高或過低都會給酒體呈香帶來負面影響，WX-1紅曲米制成的紅曲柿子酒中含有較多的辛酸，WX-2紅曲米制成的紅曲柿子酒中還有較多的棕櫚酸，這些酸類對果酒風味都會產生不良影響。

表3 3種紅曲柿酒中的揮發性酸類物質Table 3 Volatile acids components in three kinds of red kojic persimmon wine

2.3 武宣地區3種紅曲米細菌菌群α-多樣性分析

武宣地區3種紅曲米樣品中細菌菌群序列數及α-多樣性分析結果見表4，紅曲米樣品細菌稀釋曲線見圖3。

表4 武宣地區3種紅曲米細菌菌群序列數及α-多樣性分析結果Table 4 Results of sequence numbers and α-diversity analysis of bacterial community of three kinds of red kojic rice samples from Wuxuan areas

圖3 武宣地區3種紅曲米樣品細菌稀釋曲線Fig.3 Dilution curves of bacteria in three kinds of red kojic rice samples from Wuxuan areas

由表4可知，樣本的覆蓋率指數平均值為97.2%。由圖3可知，當測序量較低時每個紅曲米樣品的Shannon指數均隨著測序量的增加呈顯著上升趨勢，當測序量＞10 000后，稀釋曲線與X軸幾乎接近平行，Shannon指數幾乎達到上限。說明在當前測序水平下，樣品中的細菌群落多樣性已能夠充分覆蓋。由表4亦可知，從3種紅曲米中共獲得234 866條細菌有效序列。序列按97%相似度水平進行OTU聚類劃分，3種紅曲米樣本中共獲得6848個OTU，其中紅曲米樣品WX-1中細菌OTU數量最多，為2 961個，種群多樣性指數Shannon指數最高，為2.564；而紅曲米樣品WX-2中細菌菌群的ACE指數、Chao1指數最高，分別為234 092.1、61 749.15。說明紅曲米樣品WX-1細菌群落的物種種類最豐富；紅曲米樣品WX-2細菌群落數目最多。

2.4 武宣地區3種紅曲米細菌不同分類水平上的豐度分析

在門分類水平上，從3種紅曲米樣品共檢測出19個細菌門。將相對豐度＞1%的菌門定義為優勢細菌門，優勢細菌門見圖4。由圖4可知，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）為3種紅曲米樣品的共有優勢菌門。其中變形菌門（Proteobacteria）占比最高（49.3%～97.5%），為最主要的優勢菌門。厚壁菌門（Firmicutes）在紅曲米樣品WX-2中占據較大比例（50.64%），為紅曲米樣品WX-2中的主要優勢菌門。結果表明，3種紅曲米樣品中所含物種基本相似，但其細菌菌門結構存在一定差異。

圖4 基于門水平武宣地區3種紅曲米樣品細菌菌群結構分析Fig.4 Analysis of bacterial community structure of three kinds of red kojic rice samples from Wuxuan area based on phyla level

在屬分類水平上，武宣地區3種紅曲米樣品中共檢出239個屬，為了展示效果，一般只顯示相對豐度前25的物種分類，前25種菌屬相對豐度熱圖見圖5。將菌屬數量經過lg（n+1）標準化后大于3的菌屬定義為優勢菌株。

由圖5可知，伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、未分類細菌（unclassified）為3種紅曲米樣品的共有優勢菌屬。紅曲米樣品WX-1中優勢菌屬有13種，說明WX-1樣品細菌種群復雜程度高，紅曲米樣品WX-2中優勢菌屬有醋菌屬（Acetobacter）、小球菌屬（Pediococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus），均為產酸菌株。而紅曲米樣品WX-3中細菌相對豐度和細菌種群復雜程度都較低。

對紅曲米細菌屬豐度進行標準化層次聚類后得到相對豐度（0～4），數字越大表示該菌屬相對含量越高。

圖5 武宣地區3種紅曲米細菌屬相對豐度熱圖Fig.5 Heatmap of relative abundance of bacteria genera of three kinds of red kojic rice samples from Wuxuan area

在屬分類水平上，紅曲米中主要產酸菌屬有克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳酸桿菌屬（Franconibacter）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、小球菌屬（Pediococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus），不動桿菌屬（Acinetobacter）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium），它們的產酸機理[18-21]見圖6。3種紅曲米中產酸菌株在種類和相對豐度上均有差異，其中，紅曲米樣品WX-2產酸菌株種類最多，且菌株對應的相對豐度最高。而紅曲米WX-2樣品發酵而成的紅曲柿酒的總酸、揮發性成分均高于其他兩種紅曲柿酒，說明紅曲細菌群落結構與紅曲柿酒中酸類物質的形成緊密相關。

圖6 3種紅曲米中產酸菌產酸機理Fig.6 Acid-producing mechanism of acid-producing strains in three kinds of red kojic rice samples

3 結論

該研究以武宣地區3種紅曲米作為發酵劑釀造的紅曲柿酒總酸和揮發酸含量差異顯著（P＜0.05），且揮發性酸類物質組成存在較大差異，其中，紅曲米樣品WX-2制成的紅曲柿酒揮發性酸類物質含量最高（10.0%）。應用Illumina MiSeq高通量測序技術檢測3種武宣紅曲米細菌多樣性，研究發現紅曲米樣品WX-1細菌群落中物種的種類最豐富，紅曲米樣品WX-2細菌群落中物種數目最多。從3種紅曲米樣品共檢測出19個細菌門，239個細菌屬，共有優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）；共有優勢菌屬為伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella），WX-2樣品中優勢菌屬還有醋菌屬（Acetobacter）、小球菌屬（Pediococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus），均為產酸菌株。表明紅曲米細菌群落結構與紅曲柿酒酸類物質的形成緊密相關。