釀酒酵母ZGJ-1在獼猴桃果酒發酵中的研究及應用

孫美玲，吳杰雄，李新瑞，商飛飛

（1.湖北大學知行學院 糧食與食品工程學院，湖北 武漢 430011；2.賀州學院 食品與生物工程學院，廣西 賀州 542899）

以獼猴桃果實為原料，通過酵母菌發酵釀制而成的果酒兼具營養和保健雙重功能，既含有獼猴桃維生素C、維生素B族、碳水化合物、蛋白質、脂肪、鈣、鐵、磷、硒等營養物質；又有發酵型果酒促進血液循環和機體的新陳代謝，控制體內膽固醇水平，改善心腦血管等保健功效[2-3]。王東偉等[4]以黃心獼猴桃為原料發酵果酒，在發酵溫度22.07 ℃，初始糖度為22.58°Bx，酵母接種量0.13%條件下，酒精度可達8.94%vol；在果酒陳釀期間，隨著陳釀時間的延長，黃心獼猴桃果酒的抗氧化能力和酚類物質含量均有所降低。相同陳釀時間下，4 ℃陳釀的黃心獼猴桃果酒的體外抗氧化能力高于18 ℃陳釀的獼猴桃果酒。孫洪浩等[5]研究了野生獼猴桃發酵最佳工藝參數：果膠酶用量80 mg/L，SO2添加量為72 mg/L，發酵基質初始pH 3.5，活性干酵母接種量300 mg/L，發酵溫度25 ℃，該工藝釀造的野生獼猴桃干酒口感豐滿、香氣協調、維生素C含量高。

釀酒酵母ZGJ-1（專利號：ZL201210561882.X）是項目組人員從自然界野生資源中分離純化并已改良的高產酒發酵專用菌株，該菌株具備發酵性能強、產香好、產酒品質穩定等特點，并通過了中國典型專利培養物保藏中心鑒定（保藏號為CCTCC NO：2012472）。本研究以項目組分離純化的純天然果酒專用菌種ZGJ-1為發酵菌株，采用游離與固定化兩種方式發酵獼猴桃汁，制備適合大眾口味的獼猴桃果酒，利用單因素及正交試驗對其發酵工藝條件進行優化，并考察其抗氧化活性，既實現了菌株ZGJ-1的應用開發，又為獼猴桃的深加工提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ZGJ-1：中國典型培養物保藏中心。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、苯酚、酒石酸鉀鈉、蔗糖，磷酸二氫鉀、偏重亞硫酸鉀、海藻酸鈉、無水氯化鈣、七水硫酸鎂：國藥集團化學試劑有限公司；果膠酶（20 000 U/g）：北京美的生物技術有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：北京Solarbio公司。試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

斜面培養基：麥芽汁1 000 mL，瓊脂20 g，121 ℃高溫滅菌20 min。

酵母增殖培養液[6-7]：葡萄糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏10.0g、七水硫酸鎂0.2g、磷酸二氫鉀0.2 g，蒸餾水1000 mL，pH 5.0，115 ℃高溫滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SYQ-DSX-280D高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；THZ-C恒溫振蕩器：江蘇太倉市實驗設備廠；SW-CJ-2D凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；WFJ7200可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；PYX-190S-A恒溫培養箱：廣東韶關科力實驗儀器公司；PHS-C酸度計：上海宇隆儀器有限公司；1049酒精計：余姚儀表二廠有限責任公司；TG16-WS高速離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 游離酵母ZGJ-1制備獼猴桃果酒的工藝流程

1.3.2 固定化酵母ZGJ-1制備獼猴桃果酒工藝流程

1.3.3 操作要點

獼猴桃果汁原液的制備：挑選成熟度較好的獼猴桃，清洗果皮，去皮后按10%的比例加水榨汁，采用果膠酶澄清過濾，果膠酶使用前按果膠酶∶水=1∶10的比例，采用35 ℃水活化30 min，然后按0.25%比例添加于果漿中混合均勻，靜置酶解12 h。加蔗糖、檸檬酸等[8]（符合GB 2760—2011《食品添加劑使用標準規定》），調整果汁pH（3.0～4.0）、起始糖度200 g/L，將制備的果汁原液分裝到500 mL發酵瓶中（裝液量70%），發酵瓶標注游離與固定化，置于95 ℃滅菌15 min，再冷卻至常溫，待用。

酵母菌ZGJ-1的活化：取28 ℃培養48 h的斜面菌，用無菌水將菌苔洗下，倒入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，充分振蕩制成菌懸液，使菌懸液的細胞濃度達到（1.8～2.6）×108個/mL。取5%菌懸液加入滅菌增殖培養液中，28 ℃、200 r/min振蕩培養32～36 h，得到酵母菌ZGJ-1的活化液。

海藻酸鈉溶液2%（包埋劑）[9]：稱取1.0 g海藻酸鈉，用少量去離子水調成糊狀，再加水至40 mL，適當加熱溶化，分裝到小燒杯10 mL，0.1 MPa滅菌15 min后，冷卻至45 ℃備用。

CaCl2溶液（誘導劑）[10-11]：稱取無水氯化鈣1.5g，用100mL去離子水溶解，并分裝于2個250 mL錐形瓶中，0.1 MPa滅菌15 min，冷卻備用。

酵母細胞的固定化[12]：無菌狀態下，取菌液加入包埋劑中，混勻，凝膠內包埋菌量為（3.8～4.6）×107個/mL；用無菌滴管緩慢而穩定的速度滴入50 mL的氯化鈣溶液中，邊滴邊搖晃錐形瓶，制得直徑約為3 mm的凝膠珠；在誘導劑中鈣化30 min，用無菌漏勺濾出，用無菌水沖洗3次，即可倒入裝有發酵液的對應發酵瓶中，用保鮮膜封口。

接種、前酵：按200 g/L的比例添加蔗糖將果汁總糖進行調節，將游離與固定化酵母菌種ZGJ-1分別接入已滅過菌的果汁液中，接種比例控制在1%～10%，發酵瓶蓋密封口，維持起始溫度25 ℃靜置培養、前酵時間約4～6 d，以糖度的下降量監測發酵的進程，72 h后將溫度提高至28 ℃，隨著發酵時間的延長，記錄對發酵能力的影響程度。

后發酵：當酒精度達到8%vol時，終止前發酵，調整發酵溫度為16 ℃進入后發酵階段，直至總糖含量降至40 g/L終止發酵。

陳釀：將發酵液進行倒罐，于5 ℃條件下陳釀3個月。

澄清、過濾：將陳釀的酒分離得到酒腳，加入適量皂土進行澄清過濾。

滅菌：于75 ℃條件下滅菌15 min，得到獼猴桃果酒成品。

1.3.4 獼猴桃果酒發酵工藝優化正交試驗

采用游離酵母及固定化酵母分別制備獼猴桃果酒，在單因素試驗基礎上，以酒精度及殘糖含量為評價指標，用正交試驗考察SO2添加量（A）、酵母接種量（B）、起始糖度（C）對獼猴桃果酒品質的影響，優化果酒發酵工藝，正交試驗因素與水平見表1。

表1 獼猴桃果酒發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for kiwifruit wine fermentation technology optimization

1.3.5 質量檢測

獼猴桃果酒感官指標、理化指標測定按照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；微生物指標測定按照國標GB 4789—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》；其他指標測定參照獼猴桃果酒的行業標準QB/T 2027—1994《獼猴桃酒》。

1.3.6 抗氧化能力的測定

（1）羥自由基（·OH）清除率的測定

按照文獻[13-14]進行測定，羥基自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為未加酒樣的測定值；A1為加酒樣的測定值；A2為果酒本底測定值。

（2）超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定

按照文獻[15-16]進行測定，超氧陰離子自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為空白樣吸光度值；AS為待測樣品吸光度值。

（3）DPPH自由基（DPPH·）清除率的測定

按照文獻[17-18]進行測定，DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為對照的吸光度值；A1為樣品反應體系的吸光度值；A2為果酒本底吸光度值。

2 結果與分析

2.1 酵母菌ZGJ-1產酒能力測定

酵母菌種的發酵性能直接影響果酒品質，用發酵能力和繁殖能力較高、抗SO2能力較強的酵母啟動發酵，可提高酒精發酵速率，而且釀造的果酒品質好[3]。如圖1所示，當采用5%的接種量將游離與固定化酵母分別接種于滅過菌的果汁液中，維持25 ℃恒溫發酵時，固定化酵母菌較游離酵母遲緩期的時間要短，72 h后將溫度提高至28 ℃，此時固定化酵母進入主酵速度更快，產能代謝物更多。結果表明，固定化酵母發酵所產酒精含量高，產率大，菌種的發酵特性好。

圖1 游離與固定化菌種對獼猴桃果酒酒精度的影響Fig.1 Effects of free and immobilized strains on alcohol content of kiwifruit wine

2.2 酵母ZGJ-1發酵全汁獼猴桃果酒工藝參數確立的試驗結果

2.2.1 游離酵母ZGJ-1發酵獼猴桃汁最佳發酵工藝參數

表2 游離酵母ZGJ-1發酵獼猴桃汁工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of kiwifruit juice with free yeast ZGJ-1

由表2可知，SO2添加量、酵母接種量和起始糖度均對獼猴桃果酒的酒精度、殘糖含量等指標產生了較為顯著的影響，影響順序為B＞A＞C，即酵母接種量＞SO2添加量＞起始糖度。以酒精度及殘糖含量為評價指標，最佳發酵工藝組合為A2B2C1，即SO2添加量100 mg/L、酵母接種量5%和起始糖度200 g/L。在此最佳發酵工藝條件下，獼猴桃果酒酒精度8.3%vol，殘糖35.64 g/L，且酒體色澤均勻、品嘗適口。

2.2.2 固定化酵母ZGJ-1發酵獼猴桃汁最佳發酵工藝參數

表3 固定化酵母ZGJ-1發酵獼猴桃汁工藝優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of kiwifruit juice with immobilized yeast ZGJ-1

續表

由表3可知，各因素對酒精度及殘糖含量的影響順序為A＞B＞C，以酒精度及殘糖含量為評價指標，正交試驗得到的最優發酵工藝組合為A2B2C1，即SO2添加量100 mg/L、酵母接種量5%和起始糖度200 g/L。在此工藝參數下，釀造所得獼猴桃果酒酒精度為9.6%vol，殘糖為32.28 g/L，且具有獼猴桃清新的果香和醇厚、清雅、諧調的酒香，口感清爽。

2.3 固定化酵母ZGJ-1發酵獼猴果酒產品的質量檢測

由以上試驗結果顯示，固定化酵母ZGJ-1發酵獼猴桃汁比游離酵母ZGJ-1發酵獼猴桃汁的酒精度、口感、色澤均更好。在發酵工藝條件為SO2添加量100 mg/L、起始糖度200 g/L，滅菌后按5%接種酵母進入前酵。起酵溫度25 ℃，主酵溫度28 ℃，當酒精度達到8%vol時，終止前發酵，調整發酵溫度為16 ℃進入后酵階段，直至總糖含量降至40 g/L終止發酵。進一步將發酵液進行倒罐，于5 ℃條件下陳釀3個月，分離得到酒腳，加入適量皂土進行澄清過濾，于75 ℃條件下滅菌15 min，得到獼猴桃果酒成品，取樣進行檢測，獼猴桃果酒質量檢測結果見表4～6。

表4 獼猴桃果酒感官評價結果Table 4 Sensory evaluation results of kiwifruit wine

表5 獼猴桃果酒理化指標檢測結果Table 5 Determination results of physicochemical indicators of kiwifruit wine

表6 獼猴桃果酒微生物指標檢測結果Table 6 Determination results of microorganism indictors of kiwifruit wine

由表4～6可知，獼猴桃果酒感官指標、理化指標、微生物指標均滿足相關國標要求。

2.4 固定化酵母發酵的果酒成品抗氧化能力測定結果

DPPH能形成穩定的醇溶性自由基，自由基清除劑存在時可與DPPH自由基單電子配對，使其在波長517 nm處的吸收逐漸消失，與乙醇溶液形成的深紫色變淺，其褪色程度與其接受的電子數成線性關系，從而評價出樣品的抗氧化能力[19-20]。由圖2可知，采用的3種抗氧化評價方法，其顯示的評價結果有一定差異。綜合來看，獼猴桃果酒的抗氧化能力是最高的，對·OH、DPPH·及O2-·清除率分別為42%、96%、80%。

圖2 獼猴桃果酒的抗氧化能力檢測結果Fig.2 Determination results of antioxidant capacity of kiwifruit wine

3 結論

當固定化與游離酵母菌ZGJ-1對獼猴桃全汁進行發酵，其固定化酵母菌進行發酵的果酒品質明顯優于游離酵母菌發酵，且最優參數為SO2添加量100 mg/L、起始糖度200 g/L，后按照200 g/L的比例添加蔗糖將果汁總糖進行補充調節并滅菌，固定化酵母接種量5%時所獲得的獼猴桃果酒酒精度≥8%vol，具有典型清爽的獼猴桃果香和濃郁的酒香，口味純正柔和，風格獨特，具有較好的抗氧化能力。

隨著對釀酒酵母ZGJ-1在果酒領域的市場開發，將有效解決市場上專用發酵菌種缺乏、產品風味不穩定、產品質量不穩定，比如酒體顏色加重、氧化感增加、果香變淡，失光、沉淀等現象，也將為果農增收、社會生態等產生效益。