新型燃料生物丁醇研究進展

汪江波，孔 博，蔡林洋，王 浩，張瑞景，蔡鳳嬌，徐 健

（湖北工業大學 生物工程與食品學院 工業發酵湖北省協同創新中心 發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

由于全球能源危機和化石燃料供應有限，可再生能源受到越來越多的關注。生物燃料作為當前研究最熱且最廣泛的新能源之一，是以生物質作為載體，產生固、液、氣等綠色可持續發展的能源[1]。目前應用最多的生物燃料是生物柴油和生物乙醇，生物丁醇與乙醇相比具有腐蝕性低、蒸汽壓力低、可以與汽油以任意比例混合等優點[2]，因此受到了廣泛的關注。工業上生產丁醇主要采用化學合成和生物發酵兩種方法，化學合成法主要包括羰基合成法和醇醛縮合法，但是這些方法反應條件復雜，對技術和設備要求較高。生物發酵法是以淀粉和糖質等為原料，利用丁醇梭菌生產丁醇，與化學合成法相比具有眾多優勢，包括投資小、技術設備要求低、發酵條件溫和等[3]。發酵法因其產物為丙酮（acetone）、丁醇（butanol）和乙醇（ethanol），所以又稱之為ABE發酵。ABE發酵分為產酸和產溶劑兩個階段：發酵初期，菌體迅速繁殖，并產生大量有機酸（乙酸、丁酸），使發酵液酸度迅速升高，同時伴隨生產CO2和H2兩種氣體；當菌體繁殖到平穩期，酸度達到一定值后（pH達到4.3～4.5），進入產溶劑期，此時有機酸被菌體還原，酸度開始降低，同時產生溶劑（丙酮、丁醇、乙醇）[4]。目前，發酵法生產丁醇面臨的三個主要問題是（1）菌株對氧的耐受性低。用于ABE發酵生產丁醇的菌株大多是厭氧菌，在發酵時要提供一個嚴格厭氧的環境，大大增加了試驗和操作成本，因此提高丁醇生產菌株的耐氧能力是降低丁醇生產成本的關鍵措施之一；（2）生產原料成本高。研究表明，丁醇發酵過程中原料成本占總成本的70%～80%[5]，廉價且易于利用的原料是丁醇發酵所需的；（3）丁醇的轉化率和濃度低。目前，從自然界中篩選得到的丁醇生產菌通過ABE發酵生產丁醇的產量一般不超過20 g/L，轉化率低于0.3 g/g[6]。造成這種現象的原因是發酵生成的溶劑（尤其是丁醇）對丁醇生產菌有致命的毒害作用，造成丁醇轉化率和濃度較低，因此微生物對丁醇耐受性低是阻礙發酵法生產丁醇的最大瓶頸之一。本文從丁醇生產菌對氧的耐受性、發酵原料的選擇、丁醇生產菌對溶劑的耐受性差導致的丁醇轉化率和濃度低以及丁醇的原位提取等方面綜述了生物丁醇生產的研究現狀，討論了ABE發酵存在的問題并提出改進策略，以期為丁醇生產菌株的定向改造及發酵過程控制優化提供借鑒。ABE發酵代謝途徑如下：

①丙酮酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶；②硫解酶；③β-羥丁酰CoA脫氫酶；④丁烯酰CoA水解酶；⑤丁酰CoA脫氫酶；⑥CoA轉移酶；⑦乙酸激酶；⑧輔酶A轉移酶。

1 丁醇生產菌對氧的耐受性

用于ABE發酵的梭菌大多屬于專性厭氧菌，氧對于這些細菌是有害甚至是致命的，當有氧氣存在時，細胞內容易產生性質不穩定的會破壞各種具有生物活性的大分子，對細胞造成致命的傷害[7]。最新研究表明，在產丁醇梭菌中存在一類調控蛋白稱為過氧化物還原機制調節抑制因子（peroxide repressor，PerR），在有氧環境下，它們可以抑制厭氧梭菌啟動自身的氧化應激防御系統來清除氧和活性氧，導致它們無法在有氧環境下生存[8]。利用關鍵基因過表達或基因敲除技術對產丁醇梭菌進行遺傳改造，可以提高菌株的耐氧能力以及丁醇產量。裴建新等[9]研究應用Ⅱ組內含子敲除技術敲除丙酮丁醇梭菌perR（超氧化物阻遏蛋白）基因，對突變菌株進行搖瓶發酵試驗，突變菌株提高了對分子氧的耐受能力，降低厭氧環境要求，在生產發酵過程中可降低成本。肖川[8]利用二型內含子插入法成功敲除拜氏梭菌產溶劑退化菌株Clostridium beijerinckiDS中參與過氧化物還原機制調節的PerR抑制子基因Cbei_1336，獲得一株耐氧的兼性厭氧突變株，該突變株不但可以在有氧環境中生長良好，與出發菌株相比，丙酮和丁醇質量濃度分別提高至4.7 g/L和10.01 g/L。

2 生物丁醇發酵原料

2.1 淀粉質原料

富含淀粉的物質是生產生物燃料的第一代原料，如玉米、木薯等（表1）。將這些原料經預處理得到富含還原糖的水解液，然后經ABE發酵、發酵液精餾后得到正丁醇[10]。宋鋼等[11]利用木薯粉發酵生產丁醇，結果表明最佳培養基為木薯粉120 g/L，乙酸銨6 g/L，此時5 L發酵罐中丁醇產量達到13.5 g/L，總溶劑達到22.8 g/L。雖然富含淀粉的物質是丁醇發酵的良好底物，但生物燃料生產對這些底物需求的增加也提高了這些原料的價格，因此需要尋找廉價且適宜的原料用于丁醇的生產。

表1 不同菌株和底物的丁醇發酵情況Table1 Butanol fermentation of different strains and substrates

2.2 木質纖維素

木質纖維素是生產生物燃料的第二代原料，是典型的高效發酵基質的良好替代品。但是，從這些木質纖維素材料中獲得可發酵性糖是非常困難的，木質纖維素在用作發酵底物之前，需要經過物理、化學或生物預處理，同時會產生弱酸類、呋喃類和酚類化合物等對微生物有毒害作用的副產物[12]。MAGALHAES B L等[13]從甘蔗秸稈水解液中篩選出產丁醇的梭狀芽孢桿菌，通過優化培養基提高了該菌對木質纖維素水解物的耐受性，避免在水解物中過早的停止發酵，并使菌株能在79%的純木質纖維素水解物中培養，最終總溶劑產量達到10.22 g/L。目前阻礙大規模利用木質纖維素作為生物丁醇發酵基質的直接因素是預處理過程成本過高，因此迫切需要開發從木質纖維素生物質中獲得可發酵糖的有效技術，以獲得比玉米等易水解原料更低的成本優勢。

2.3 微藻和甘油

微藻是生產生物燃料的第三代原料，利用微藻生產生物丁醇，具有廣闊的前景[13]。微藻含有的碳水化合物主要是以淀粉的形式存在的，經過簡單的酸處理或者堿處理就可以獲得大量的還原糖。微藻中含有較少半纖維素和木質素，這可以降低預處理成本。纖維素原料預處理時，會釋放出一系列的有害物質，干擾發酵過程，而微藻生物質酸水解產物只含有微量的糠醛和5-羥甲基糠醛（0.5 g/L）。研究表明，丁醇發酵的菌株可以耐受1 g/L糠醛和2 g/L 5-羥甲基糠醛，因此微藻水解液不會對丁醇發酵產生影響，是發酵生產丁醇的理想原料[14]。微藻預處理技術主要有四種，包括熱處理、機械處理、化學和生物（酶法）方法。WANG Y等[15]以小球藻（Chlorella vulgaris）JSC-6作為原料，利用C.acetobutylicumATCC824生產丁醇，先經過1%NaOH處理再經過3%硫酸處理得到小球藻的水解液，經分批培養后得到13.1 g/L的丁醇。

甘油是一種重要的可再生碳源，在工業生產中被廣泛用作發酵的底物。以甘油為唯一碳源進行發酵的第一個溶劑生產菌是巴氏梭菌，甘油通過磷酸化和氧化兩種途徑，部分轉化為可用于糖酵解途徑的二羥基丙酮磷酸鹽（dihydroxyacetone phosphate，DHAP）[10]。粗甘油用于生產丁醇的主要問題是雜質的抑制作用，在酯交換后，甘油通常含有不同濃度的甲醇（生物柴油甲基化過程的殘留物）、硫酸鹽或氯鹽、游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）、脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester，FAME）和肥皂（作為氫氧化物酯交換催化劑和FFA的副產品）。解決這種抑制作用的方式有兩種，第一種是通過粗甘油的純化來消除這種抑制作用，但是會增加成本；另一種方式是獲得對粗甘油有適應能力的菌株，但是該菌株只適應于一種特定類型的粗甘油，對于含有其他雜質的粗甘油也可能有毒性。因此，可以選擇固定化微生物及其凝膠基質的保護，消除粗甘油的毒性作用[16]。VLADIMIR K等[17]研究以甘油為原料，利用巴氏梭菌生產丁醇，采用固定化細胞重復分批發酵并與自由細胞發酵對比，結果表明采用聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）顆粒固定化細胞發酵明顯縮短了發酵時間，丁醇產率提高了6.3倍。

3.4 食品廢棄物

目前，從食品廢棄物中生產丁醇受到了廣泛的關注。與昂貴的淀粉質原料相比，利用食品廢棄物生產丁醇，不僅能解決環境問題，也為丁醇生產提供了廉價的原材料。SIREN L G等[18]以西米果仁渣為原料，經酶解后通過丙酮丁醇梭菌進行ABE發酵，研究發現將西米果仁渣水解物增至50 g/L時，加入0.5 g/L酵母菌抽提物，ABE產量為8.84 g/L。王永林等[19]利用糖乙酸丁酸梭菌N1-4，將餐廚垃圾直接發酵生產丁醇，在固液比1∶1（g∶mL）的條件下，餐廚垃圾直接發酵丁醇產量達到12.1 g/L，證明了餐廚垃圾發酵生產丁醇的可行性。QIU Z D等[20]分離出一種可以自主分泌淀粉酶并生產丁醇的梭狀芽孢桿菌（Closridiumsp.）HN4，在食品廢棄物中添加碳酸鈣和吐溫80可以顯著提高菌株的淀粉酶表達能力，在進行分批發酵和原位提取后丁醇產量達到35.63 g/L。

3 丁醇轉化率和濃度

ABE發酵生產丙酮、丁醇、乙醇等有機溶劑，其中丁醇對細胞傷害最大，由于丁醇生產菌對丁醇的耐受性差導致丁醇轉化率和濃度低。有機溶劑對大多數微生物都具有毒害作用，它們會在細胞膜中積累并破壞其結構，導致細胞內的離子和代謝物丟失，pH和膜電位發生改變，最終導致細胞死亡[30]。但在一些情況下，微生物也可以通過自身的抗性機制在有機溶劑中存活，例如細菌可以通過細胞膜修飾來降低溶劑的滲透性；溶劑進入細胞會引發應激反應，其中涉及許多分子伴侶，一些微生物還可以通過降解化合物產生能量來對抗溶劑的毒性，外排泵也對細胞中去除有機溶劑起關鍵作用[31]。丁醇生產菌對丁醇的耐受機制如圖1所示。（1）細胞膜：在亞致死濃度下（通常為5～15 g/L），丁醇引發復雜的應激反應，包括膜流動性的增加、膜脂中飽和/不飽和脂肪酸比例發生變化；當丁醇質量濃度＞15 g/L時會導致膜功能受損，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）泄露和pH梯度被破壞，最終導致細胞死亡[32]。因此可以通過改變膜的生理特性或轉運系統來抵御丁醇脅迫，例如增加外膜的脂多糖含量使細胞表面疏水性降低，阻礙有毒疏水化合物進入胞質等。（2）外排泵：天然的外排系統不能結合丁醇使之排出胞外，而定位于細胞質膜上的轉運蛋白耐藥結節細胞分化（resistance-nodulation-cell division，RND）外排泵能將胞內有毒化合物泵出胞外。FISHER M A等[33]的研究結果表明，改變RND家族的外排泵的AcrB蛋白中的一個氨基酸時，能夠有效地排出丁醇，證明定向進化改變外排泵底物特異性，是有效的排出丁醇的一種方法。（3）應激蛋白過表達：丁醇生產菌所產生的應激反應在許多方面與熱休克所產生的應激相似，因此它也可能與各種熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）的產生有關，這些熱休克蛋白參與蛋白質折疊、運輸、修復受損或錯誤折疊的蛋白質的過程，并且具有分子伴侶的活性。研究發現GroESL伴侶體系過表達，丁醇耐受性和產量提高，并可由丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）ATCC 824中調控的6S RNA過表達觸發。過表達HSPs、GrpE和HtpG也可顯著提高C.acetobutylicumATCC 824的丁醇耐受性[32]。（4）其他調控機制：有研究表明添加微量鋅離子一方面增強菌體對數生長、碳源利用、有機酸重吸收及溶劑代謝，提高丁醇產率；另一方面增強菌體對甲酸、乙酸、丁酸及丁醇的脅迫耐受性，有效緩解代謝遲滯，丁醇耐受水平得到提高[34]。

圖1 丁醇生產菌對丁醇的主要耐受機制Fig.1 Main tolerance mechanism of butanol-producing strain to butanol

目前提高菌株對于丁醇的耐受性主要有三種方式：（1）物理或化學誘變；（2）基因改造；（3）人工馴化。LI H G等[35]通過分離和連續富集的方法獲得一株耐丁醇突變株SE36，與野生菌株相比突變株對丁醇的耐受能力從20 g/L提高到35 g/L，經發酵后的丁醇和總溶劑產量分別比野生菌提高了24.3%和23.6%。SHU B L等[36]為獲得耐溶劑性和產丁醇能力較強的菌株，采用亞硝基胍誘導與基因組重排相結合的誘變方法，在連續四輪基因組重組之后，重組菌株C.acetobutylicumGS4-3表現出較強發酵性能，優化后丁醇產量為20.1 g/L，丁醇產率為0.35 g/（L·h），分別比野生型菌株GX01增加了23.3%和40.0%。

4 丁醇分離提取技術

4.1 吸附

吸附是通過將丁醇吸附到合適的表面吸附劑上，然后增加溫度或使用置換劑濃縮丁醇溶液，從而選擇性地從發酵液中分離丁醇的方法。在選擇合適的吸附劑時，需要考慮許多因素：吸附速率、吸附容量、易降解性，對所需產品的選擇性和成本等[37-38]，目前常用的吸附材料主要有活性炭、聚合樹脂、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）等。XUE C等[39]研究了各種吸附劑對丁醇的吸附性能，發現活性炭對于丁醇的吸附效果最佳，通過活性炭原位吸附和補料分批發酵得54.6 g/L丁醇，與沒加吸附劑的對比，產量增加了230%。吸附法能耗低、操作簡單，但對丁醇吸附容量較低，仍需要進一步通過其他方法濃縮丁醇。

4.2 液液萃取

液液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）是通過選擇對微生物毒性較低的水不溶性萃取劑，并與發酵液混合，選擇性的提取丁醇的方法。在選擇萃取劑時要考慮三個因素：萃取劑對每個產品（尤其是丁醇）的分配系數、選擇性和毒性[40]。研究發現，越是對丁醇有較高的分配系數的液體萃取劑對細胞的毒性就越大。因此，影響液液萃取法對丁醇進行萃取分離的一個關鍵因素是萃取劑的毒性。潘賀鵬等[41]研究利用小麥淀粉廢水生產生物丁醇，通過考察丁醇發酵的影響因素，得出最佳培養基條件，在7 L發酵罐中結合生物柴油進行萃取發酵，總溶劑和丁醇產量分別達到29.38 g/L和15.13 g/L，相比萃取之前分別提高了27%和12%。液液萃取可以直接從發酵液中提取丁醇，而不需要移除底物、水或者營養物質。但是在使用過程中也會出現一些問題，例如：萃取劑的毒性、乳狀液的形成、萃取過程中生物質的積累等，因此液液萃取法的工業化應用目前仍受到一定限制。

4.3 滲透汽化

滲透汽化是利用膜對液體混合物中各組分的溶解與擴散速度的不同而實現分離的過程。所用膜主要包括高聚物膜、陶瓷膜和液體膜等。其中，聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）膜由于其超疏水性以及良好的熱穩定性和機械穩定性而被廣泛研究。WU H等[42]采用PDMS-陶瓷復合膜在丁醇分批發酵過程中進行原位提取，丁醇產量提高33%。滲透汽化作為一種新型膜分離技術具有選擇性高、能耗低、產品純度高等優勢，但是其分離性能很大程度上是取決于膜的性質，由于生物分子、介質成分和細胞引起的膜污染會導致滲透汽化性能下降[56]，一定程度上限制了其工業化應用，高性能膜的制備和發現還需要更多的研究。

4.4 氣提

氣提法是通過向發酵液中通入無氧氮或發酵氣體（H2和CO2），從而脫去丙酮、丁醇和乙醇的方法[37]。CAI D等[43]以甜高粱汁為原料，采用連續氣提補料分批發酵，最終獲得丁醇質量濃度達到112.9 g/L。EZEJI T C等[44]利用拜氏梭菌BA101進行間歇式發酵與氣提相結合的方法生產丁醇，經發酵后丁醇產量達到151.7 g/L。氣提法操作簡單、適用范圍廣、設備能耗低、與發酵耦合可以實現在線同時分離，但是處理效率會受到載氣回收速率、氣泡大小和消泡劑等眾多影響，因此有待進一步研究。

4.5 混合提取

吸附、氣提、液液萃取以及滲透汽化等方法都能在一定程度上回收丁醇，但是由于ABE發酵中丁醇質量濃度通常小于20 mg/L，這些分離技術對丁醇的純化沒有足夠的選擇性。因此，根據現有的資料，從技術和經濟的角度來看，需要進行更多的研究來開發一種綜合工藝，使用一種或多種不同的提取方式的組合，從發酵液中分離丁醇。LU K M等[45]采用新型的原位萃取-氣體汽提工藝結合ABE發酵，在發酵過程中首先用油醇提取丁醇，同時在油醇相中對丁醇進行氣提，最終的得到丁醇質量濃度為93～113 g/L。CAI D等[46]為提高丁醇質量濃度，降低產品分離成本，建立了氣提-滲透蒸發（gas stripping-pervaporation，GS-PV）一體化工藝，將間歇滲透汽化技術與補料分批ABE發酵氣提系統相結合，獲得丁醇質量濃度為482.55 g/L，丁醇回收率達到98.8%。

表2 不同分離提取方法的丁醇發酵情況Table 2 Butanol fermentation with different separation and extraction methods

5 展望

丁醇作為一種燃料具有廣闊的發展前景，它可以成為替代汽油的可再生能源。丁醇發酵存在原料成本高、菌株對氧以及溶劑的耐受性差導致的丁醇轉化率和濃度低等缺點，使得丁醇發酵的競爭力低于其他生物燃料的生產。但是這些障礙正在通過以下方式得到改善：（1）通過篩選出耐氧能力強的菌株，或者通過過表達、敲除/下調以及在代謝途徑中插入編碼關鍵酶的基因等方法來提高產丁醇菌的耐氧性和丁醇產量；（2）尋找廉價且易于水解的原料作為丁醇發酵底物，或是利用廢棄物發酵生產丁醇（3）利用基因工程和代謝工程技術，解除代謝過程中可能存在的產物或者中間產物抑制，提高菌種對丁醇的耐受性，強化丁醇生產中的關鍵酶，弱化丙酮、乙醇的生成代謝途徑，提高丁醇在溶劑中比例；（4）采用混合提取的策略，彌補單一提取方法的不足，消除發酵過程中丁醇的抑制作用，提高丁醇的回收率。