細菌生物膜去除效率的定量檢測

李 宇， 江 勇， 楊 琳， 謝穎瑋

3M中國有限公司, 上海 200233

細菌生物膜是粘附于載體表面，由細菌和自身分泌的胞外基質形成的一種膜結構，其主要成分為胞外多糖蛋白質復合物，能夠極大的增強細菌的抗藥性和抗免疫能力等[1-3]。因此如何有效地檢測生物膜去除效率一直是生物醫學界和食品工業領域研究的熱點之一[4-6]。目前，針對生物膜去除效率的評價主要通過統計細菌數目的變化來反映[4,5]，其局限性是很明顯的，即細菌的滅殺效率并不能完全等同于生物膜的去除效率，細菌被殺死并不意味著生物膜被破壞和去除。因此開發一種新的生物膜含量的評價方法，對更直觀和科學地表征生物膜危害的防治效果將更具有實踐意義和應用價值。

多糖作為生物膜的主要成分之一，對其的研究一直以來備受關注[7-9]。在一定程度上，多糖的存在也能夠作為生物膜存在的重要標志。在本研究中，我們通過檢測消毒劑作用前后細菌生物膜中多糖含量的變化來反映生物膜的去除效率，從而為發展新的生物膜去除效率檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

紫外可見分光光度計(UV-VIS)；電加熱板；旋轉蒸發儀；安捷倫1100 凝膠滲透色譜儀(GPC)；色譜柱(HSPgel 3.0+HSPgel 5.0)；CDC生物膜反應器；磁力攪拌器等。

1.2 試劑

三氟乙酸；苯酚；濃硫酸；馬鈴薯淀粉；3M Avagard9250消毒劑；3M Avagard9206消毒劑等。

1.3 試驗方法

1.3.1試驗菌準備

在無菌條件下，挑取3～5個生長良好的銅綠假單孢桿菌(ATCC 15442)典型菌落放入100 mL無菌胰酪大豆胨液體培養基(TSB)中(300 mg/L)，在(35±2) ℃振蕩過夜培養。培養完成后，菌液濃度需達到108CFU/mL，保存備用。

1.3.2生物膜培養

按ASTM E2562的要求搭建生物膜反應器模型[10]。在主反應器中加入無菌TSB(300 mg/L)培養液500 mL。在主反應器中接種1 mL培養好的菌液，打開磁力攪拌器，使主反應器中的培養體系的轉速控制在125 r/min，將生物膜反應器放在室溫下(21±2) ℃過夜培養24 h。連接20 L TSB(100 mg/L)補液桶，以(11.7±0.2) mL/min的流速向主反應器補充新鮮培養液，同時打開主反應器的排液管，使多余的培養液流出反應器。補液培養過程持續24 h后，關閉所有反應器，取出生長好的生物膜片備用。

1.3.3消毒劑殺菌試驗

用20 mL無菌水清洗培養好的生物膜片，去除殘留在表面的游離細菌。隨后將清洗好的生物膜片放入50 mL離心管中，加入4 mL消毒劑，作用3 min后，立即向50 mL離心管中加入36 mL中和劑進行中和，充分振蕩超聲后，取菌懸液以10倍梯度稀釋進行活菌計數。

1.3.4水解方法及水解效率評估方法

取1片生長良好的生物膜片放入20 mL生理鹽水中，充分的振蕩洗脫后制成20 mL生物膜懸液，加入4 mol/L 三氟乙酸溶液10 mL[11]，在110 ℃下加熱4 h進行水解，然后在旋轉蒸發儀上濃縮至快干，獲得樣品濃縮液。

水解效率的評估主要通過安捷倫凝膠滲透色譜儀(GPC)來進行。對于水解前樣品，直接取1 mL樣品溶液，用0.45 μm濾膜過濾于樣品瓶中，進行凝膠滲透色譜(GPC)測試。對于水解后樣品，取1 mL樣品濃縮液，緩慢滴加三乙胺調節溶液pH至7.0左右，然后同樣用0.45 μm濾膜過濾于樣品瓶中，進行GPC測試。GPC測試條件為：流動相為水，選用的色譜柱為HSPgel3.0 + HSPgel5.0 (6.0×150 mm)，柱溫40 ℃，流速控制為1.0 mL/min,進樣量為2.0 μL，運行時間為20 min。

1.3.5多糖水解后的單糖含量測定方法

分別取500 μL生物膜樣品濃縮液和馬鈴薯標準品濃縮液于4 mL樣品瓶中，加入 500 μL 5%(質量分數)苯酚溶液，混合均勻后加入2.5 mL 濃硫酸，待溶液冷卻至室溫后，取溶液200 μL于96位孔板中，通過紫外可見分光光度計，于490 nm波長處測定溶液的吸光度[12]。結合馬鈴薯淀粉標準品獲得的標準曲線，計算得到水解后的單糖含量。

2 結果與分析

2.1 殺菌效率

使用兩種不同的消毒劑(3M Avagard9250和3M Avagard9206)進行殺菌處理，處理前后菌液濃度的變化以及計算得到的相應殺菌效率如表1所示。每種消毒劑重復三次實驗，可以發現，兩種消毒劑的殺菌效率都達到了99%以上，呈現出較好的殺菌效果，如以此殺菌效率作為生物膜的去除效率，則說明生物膜已經在很大程度上被破壞并去除。

2.2 生物膜定量檢測

2.2.1水解結果

表1 消毒劑殺菌效果表

馬鈴薯淀粉溶液水解前后的GPC譜圖如圖1和圖2所示。同時隨機選取一組生物膜樣品，其水解前后的GPC譜圖如圖3和圖4所示?？梢园l現，對于馬鈴薯淀粉和生物膜樣品，水解前GPC圖譜中僅有分子量大的物質存在(保留時間短)，水解后，分子量大的化合物消失，而具有小分子量的物質(保留時間長)出現，說明了水解過程的完全，生物膜和馬鈴薯淀粉中的多糖等大分子物質被水解為單糖等小分子物質，獲得了預期的水解效果，為多糖的定量分析提供了依據和可行性。

圖1 馬鈴薯淀粉溶液水解前GPC圖譜

2.2.2多糖定量標準曲線的建立

稱取馬鈴薯淀粉對照品5 mg(精確至0.000 1g)，置10 mL容量瓶，加水溶解，稀釋至刻度。 分別移取此馬鈴薯溶液0 mL、0.4 mL、1.0 mL和2.0 mL，置10 mL樣品瓶中，用水稀釋至刻度。按照1.3.4中水解方法對馬鈴薯稀釋液進行水解濃縮。

圖3 生物膜樣品水解前GPC圖譜

圖4 生物膜樣品水解后GPC圖譜

水解完成后，通過紫外可見分光光度計測定各馬鈴薯稀釋液的吸光度, 以馬鈴薯溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，如圖5所示，將依據此標準曲線對生物膜中的多糖含量進行定量。

圖5 馬鈴薯淀粉標準曲線

2.2.3多糖含量測定結果

將生物膜樣品分成A,B 兩組，每組包含三個培養良好的生物膜片，每組中各選取一個生物膜片作為參考樣，分別對其進行水解并測定其吸光度。A組其余兩個生物膜片通過3M Avagard9250消毒劑進行殺菌，同時B組其余兩個生物膜片則通過3M Avagard9206消毒劑進行滅菌，然后將所有消毒劑處理過的樣品分別進行水解，測定其吸光度。結合標準曲線，通過計算我們得到了兩組生物膜樣品中的多糖含量，以及消毒劑作用前后多糖含量的變化，從而更為直觀地展示了生物膜含量的變化以及據此計算得到生物膜的去除效率，結果如表2所示。通過對比傳統數菌方法(表1)與本研究中的方法，可以發現，以多糖含量的變化計算得到的生物膜去除效率遠低于傳統數菌方法，說明即使細菌被充分滅殺，生物膜依然能夠較大程度地保留。

表2 消毒劑作用前后多糖含量變化表

3 結論

本研究通過檢測消毒劑作用前后生物膜中多糖含量的變化來反映生物膜的去除效率，并與傳統的數菌方法進行了對比，發現以細菌的滅殺效率來反映生物膜的去除效率是不完善的，生物膜作為細菌的載體，通過消毒劑很難將其徹底去除，生物膜的去除以及去除效率的檢測都需要更為有效的手段來完成。