復方黃連油涂劑無菌檢查方法適用性研究

鄢雷娜，王繹，陳希，劉衛德，儲梅君，劉緒平*

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，南昌 330029；2.國科健康控股（江西）有限公司，南昌 330029

復方黃連油涂劑是由黃連、地榆、黃柏、黃岺、生大黃、虎杖、冰片和麻油香精組成，具有清熱消腫，止痛解毒，排膿祛腐，消炎生肌等功效。用于Ⅰ-Ⅲ度燒燙傷，以及壓瘡、糖尿病足等局部皮膚潰瘍的治療。按照《中國藥典》2015 版四部通則［1］涂劑項下規定，應對該品種進行無菌檢查。該品種處方中麻油為油性基質，在樣品前處理時，應對樣品進行充分的乳化后再進行無菌檢查。中藥外用涂劑的無菌及微生物限度檢查報道都相對偏少，大多數的報道還是停留在按照《中國藥典》2005 年版和2010 年版建立的無菌和微生物方法的階段。本文通過參考相關文獻資料和《中國藥典》2015 年版四部通則1101［1］，采用薄膜過濾法對復方黃連油涂劑進行無菌方法適用性試驗，為該制劑的檢驗與研發提供有效可靠的參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HTY-2000A 集菌儀（杭州高德泰林有限公司）；ACB-6A1 型垂直流超凈工作臺（新加坡ESCO 公司）；Heal Force900C 型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；LDZX-40B 高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；PYX-DHS 型細菌培養箱（上海躍進醫療器械廠）；KB400 霉菌培養箱（德國BINDER 公司）；EVS2 全封閉無菌檢驗過濾培養器（浙江泰林生物技術股份有限公司）。

1.2 菌種

菌種均源自中國醫學細菌保藏中心，試驗所用菌株均為第2 代，具體信息詳見表1。

表1 菌種信息表

（續表）

1.3 培養基及試劑

培養基及試劑均經過適用性試驗驗證，符合《中國藥典》2015 年版［1］的要求。培養基具體信息見表2。

表2 培養基信息表

1.4 樣品

復方黃連油涂劑（生產單位：江西本草天工科技有限責任公司；規格：每瓶100 mL）。

2 方法與結果

2.1 無菌檢查方法學驗證試驗

2.1.1 菌液的制備根據《中國藥典》2015 年版四部通則1101“無菌檢查法”項下方法的規定［1］，制得每1 mL 含菌數分別不大于100 cfu 的大腸埃希菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽胞桿菌、黑曲霉菌懸液，并對所制備的菌液進行平板計數，結果見表3。

表3 菌液計數結果 CFU/mL

2.1.2 供試液制備按批出廠檢驗量取本品10 瓶，每瓶取20 mL，置滅菌鹽水瓶中，加入42 ℃無菌十四烷酸異丙酯50 mL，振搖使其充分溶解，再加入0.1%無菌蛋白胨水溶液200 mL，充分振搖，靜置，取下層水相作為供試液。

2.2 方法適用性試驗

2.2.1 供試液的制備該試驗中每支EVS2 型集菌培養器先用約0.1%無菌蛋白胨水溶液50 mL 濕潤后，使0.1%無菌蛋白胨水溶液順利流出，再將制備好的供試液全部抽入EVS2 型薄膜過濾器內過濾；然后用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗，每張濾膜的沖洗量為500 mL（100 mL/次），然后濾干并將硫乙醇酸鹽液體培養基或胰酪大豆胨液體培養基濾入EVS2 型集菌培養器，加入少于100 cfu/mL 的試驗菌（大腸埃希菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌：硫乙醇酸鹽流體培養基；白色念珠菌、枯草芽胞桿菌、黑曲霉：胰酪大豆胨液體培養基），置規定溫度培養3～5 d，逐日觀察結果。

2.2.2 陽性對照陽性對照組每支EVS2 型薄膜過濾器先用少量0.1%無菌蛋白胨水溶液潤濕，使0.1%無菌蛋白胨水溶液順利流出，再用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗，每張濾膜的沖洗量為500 mL（100 mL/次），再分別加入各試驗菌懸液1 mL，過濾。然后濾干并將硫乙醇酸鹽液體培養基或胰酪大豆胨液體培養基濾入EVS2 型集菌培養器。

2.2.3 陰性對照陰性對照組中兩支EVS2 型薄膜過濾器分別先用少量0.1%無菌蛋白胨水溶液潤濕，使0.1%無菌蛋白胨水溶液順利流出，再用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗，每張濾膜的沖洗量為500 mL（100 mL/次），然后濾干并將硫乙醇酸鹽液體培養基或胰酪大豆胨液體培養基濾入EVS2 型集菌培養器。

2.2.3 培養條件裝有TSB 的集菌器置于23 ℃培養14 d，裝有硫乙醇酸鹽流體培養基的集菌器置于33 ℃培養14 d，逐日觀察，記錄陰性對照組、陽性對照組與試驗組6 組試驗菌株的生長情況。

2.3 驗證試驗結果

通過驗證試驗表明，本品采用薄膜過濾法過濾，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗（每張濾膜不少于500 mL，100 mL/次），6 組試驗菌株陽性對照組與試驗組生長同步無明顯差異，陰性對照組無菌生長，說明該方法基本可行，結果見表4。

表4 方法驗證試驗

3 討論

3.1 集菌培養器的選擇

復方黃連油涂劑是油性制劑，在預實驗時采用APY220 型集菌培養器，抽濾樣品時出現壓力過大或過濾速率過慢，長時間過濾不下去等現象，增加了染菌的風險，嚴重影響了結果判斷的準確性［2,3］。后采用EVS2 型集菌培養器，上述問題均得到解決，最后試驗確定選用EVS2 型集菌培養器。

3.2 供試液制備方法的考察

一些口服和外用中藥制劑常含有較復雜的中藥成分，這些成分均有不同程度的抑菌作用，所以在建立中藥制劑無菌檢查和微生物限度檢查方法時需把消除樣品的抑菌性考慮進去。本制劑含有黃連、地榆、黃柏、黃岺和生大黃等多種中藥成分，地榆中的鞣質、生大黃中的蒽醌類和黃連中的異喹啉類生物堿均有不同程度的抑菌作用，采用薄膜過濾法，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗，每張濾膜的沖洗量為500 mL（100 mL/次），可有效避免油脂類成分和一些中藥抑菌成分吸附在過濾膜上［4-10］。

復方黃連油涂劑處方中麻油為油性基質，需對樣品使用一定的乳化劑進行充分的乳化后再進行試驗，本文采用了42 ℃無菌十四烷酸異丙酯使供試品充分溶解分散，并加入0.1%無菌蛋白胨水溶液200 mL 充分萃取，靜置后取下層水相作為供試品溶液。本文考察了供試液的制備方法，根據《中國藥典》2015 年版四部的取樣標準，選擇取本品10 瓶，每瓶20 mL，加入50 mL 十四烷酸異丙酯溶解，再以0.1%無菌蛋白胨水溶液200 mL 萃取，靜置后分層效果較好，且方便操作［11,12］。

4 結論

該方法操作簡單、結果準確、方法科學，為同類油性涂劑的無菌檢查法提供了有效可靠的參考依據。