扶正化瘀膠囊調節特異性蛋白1相關通路抗心肌纖維化作用機制研究

國倩倩 吳丹丹 高毅潔

摘要 目的：觀察扶正化瘀膠囊對心梗大鼠特異性蛋白1相關通路的影響，探討其防治心肌纖維化的可能作用機制。方法：結扎左冠脈前降支建立大鼠急性心梗模型，分為模型組和扶正化瘀組。假手術組只穿線不結扎。扶正化瘀組按0.4 g/（kg·d）灌胃，模型組和假手術組給予等體積去離子水，共8周。HE和Masson染色檢測病理學變化;Western blot和實時熒光定量PCR法分別檢測特異性蛋白1（Sp1）、Gata4、轉化生長因子（TGF）-β1、Ⅰ型膠原（ColⅠ）、血小板反應蛋白1（Tsp1）及其mRNA表達。結果：與假手術組比較，模型大鼠心肌細胞破碎，纖維結締組織大量增生，膠原容積分數（CVF）增加（P<0.01），TGF-β1、ColⅠ、Tsp1 mRNA及Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ蛋白表達明顯升高（P<0.05或P<0.01），Tsp1蛋白表達降低（P<0.01）;與模型組比較，扶正化瘀組細胞膜相對完整，膠原相對減少，CVF下降（P<0.01），Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ、Tsp1 mRNA及Gata4、ColⅠ蛋白表達明顯降低（P<0.05或P<0.01）。結論：扶正化瘀膠囊在一定程度上改善心梗后心肌纖維化的作用機制可能與Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1軸有關。

關鍵詞 扶正化瘀膠囊;心肌梗死;心肌纖維化;特異性蛋白1;轉化生長因子-β1;Ⅰ型膠原;血小板反應蛋白1

Abstract Objective：To observe the effect of Fuzheng Huayu Capsule on specific protein 1 related pathway in myocardial infarction rats， and to explore its possible mechanism of prevention and treatment of myocardial fibrosis. Methods：Rats model of acute myocardial infarction were established by ligating the left anterior descending coronary artery， which were divided into model group and Fuzheng Huayu group. The sham operation group only threaded without ligation. The Fuzheng Huayu group was given intragastrically by 0.4 g/（kg·d），the model group and the sham operation group were given equal volume of deionized water for 8 weeks. Pathological changes were detected by HE and Masson staining. Western blot and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect the protein and mRNA expression of specific protein 1（Sp1）， Gata4， transforming growth factor（TGF）-β1， typeⅠcollagen（ColⅠ）and thrombospondin 1（Tsp1）， respectively. Results：Compared with the sham operation group， the model rats had myocardial cells broken， fibrous connective tissue proliferated，and collagen volume fraction（CVF）increased（P<0.01），the expression of TGF-β1，ColⅠ，Tsp1 mRNA and the expression of Sp1，Gata4，TGF-β1，and ColⅠ protein were significantly increased（P<0.05 or P<0.01），and the expression of Tsp1 protein was decreased（P<0.05）.Compared with the model group， the cells membrane of Fuzheng Huayu group were relatively intact， collagen was relatively reduced， and CVF decreased（P<0.01），the expression of Sp1，Gata4，TGF-β1，ColⅠ，Tsp1 mRNA and the expression of Gata4，ColⅠ protein were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：The mechanism of Fuzheng Huayu Capsule in improving myocardial fibrosis after myocardial infarction may be related to the Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1 axis.

Keywords Fuzheng Huayu Capsule; Myocardial infarction; Myocardial fibrosis; Specific protein 1;Transforming growth factor-β1;TypeⅠcollagen;Thrombospondin 1

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.008

心肌纖維化（Myocardial Fibrosis，MF）是以細胞外基質（ECM）過度聚集為特征的一種病理狀態，是心室重構難以逆轉的重要原因，可引起心臟收縮和舒張功能障礙，甚至惡性心律失常和猝死[1]。特異性蛋白1（Sp1）是一種細胞外基質蛋白，研究發現，Sp1相關通路Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1軸參與了心肌纖維化的病理過程，通過引發心肌細胞肥大，心肌成纖維細胞增殖，并大量轉分化為肌成纖維細胞，促使ECM沉積的促進劑TGF-β1釋放、ColⅠ增生，導致心肌纖維化的發生[2]。扶正化瘀膠囊是我國FDA批準的治療肝纖維化藥物，在臨床上取得了良好的效果[3]，本課題組前期研究發現，其還能在一定程度上防治心肌纖維化，改善心功能，下調TGF-β1表達[4]，但其作用機制仍尚不明確。因此，本研究通過建立大鼠急性心梗纖維化模型，觀察扶正化瘀膠囊對Sp1相關通路Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1軸的影響，進而研究其防治心肌纖維化的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年SD雄性大鼠，SPF級，30只，體質量（200±20） g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006。分籠飼養于北京中醫藥大學東直門醫院屏障動物實驗室，晝夜節律，自由進食飲水。

1.1.2 藥物 扶正化瘀膠囊（上海黃海制藥有限責任公司，批號180606）。

1.1.2 試劑與儀器 RNAprep pure Tissue Kit、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix、SuperReal PreMix Plus（均購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP431，KR118-02，FP205-02）;HE染色液（北京九州柏林生物科技有限公司，貨號：BLB-03，YH-102）、Masson染色液（南京建成科技有限公司，貨號：D026-20）;Sp1抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab13370）、Gata4抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab134057）、轉化生長因子TGF-β1抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab92486）、ColⅠ（Abcam公司，美國，貨號：ab90395）、Tsp1（Abcam公司，美國，貨號：ab1823）、β-actin（Abcam公司，美國，貨號：ab8226）。動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司，ALC-V8型）;心電圖機（CardiMax公司，日本，Fx-7202型）;千分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司，JA1003N型）;紫外分光光度計（Pharmacia Biotech公司，美國，Gene Quant型）;基因擴增儀（ABI公司，美國，GeneAmp PCR system 9700型）;實時熒光定量PCR儀（安捷倫科技公司，美國，Mx3000P型）;光學顯微鏡（Olympus公司，日本，BX53型）

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 根據文獻建立大鼠急性心梗模型。大鼠經腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后背位固定，氣管插管后連接呼吸機，于左胸第3、4肋間橫向打開1.5 cm左右，鈍性分離肌肉，暴露心臟，以開胸器擴大手術視野，于動脈圓錐與左心耳之間下約2 mm處用5/0手術線對左冠狀動脈前降支進行結扎，見到前壁組織迅速缺血變白后，于心臟表面滴0.1 mL利多卡因，立即關閉胸腔并逐層縫合，心電圖顯示ST段明顯抬高[5]。假手術組只穿線不結扎。術后每只大鼠分別給予0.2 mL利多卡因和速尿，并連續3 d注射40 U青霉素預防感染。術后24 h將心電圖沒有ST段改變的造模大鼠剔除后，按照隨機數字表法將剩余大鼠分為扶正化瘀膠囊組和模型組，假手術組作為對照，每組6只。

1.2.2 給藥方法 扶正化瘀膠囊按0.4 g/（kg·d）體質量灌胃（相當于臨床常用等效劑量），模型組和假手術組按5 mL/（kg·d）給予等體積去離子水，1次/d，共8周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 HE染色檢測心肌組織病理學變化 心肌組織經常規脫水石蠟包埋后，制作3 μm切片。脫蠟至水后，胞核染10 min，將玻片放入盛有去離子水的免疫修復盒中洗去多余的染色液。1%鹽酸酒精分化3 s，水中返藍10 min，胞質染2 min，洗去多余液體1 min。脫水透明封片后，鏡下觀察梗死邊緣區組織病理學變化（×400）。

1.2.3.2 Masson染色檢測CVF 組織切片經脫蠟至水后，依次經過核染色、漿染色、分化及苯胺藍復染后用無水乙醇沖洗，透明封片。采用Image-Pro Plus 6.0測算心肌膠原面積，CVF=膠原面積/（膠原面積+心肌面積）×100%，每張切片隨機選取5個無重疊視野（×200），結果以均值表示。

1.2.3.3 qRT-PCR法檢測Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ及Tsp1 mRNA表達 根據RNAprep pure Cell/Bacteria Kit試劑盒提取心肌梗死邊緣區組織總RNA，紫外分光光度計測量OD260/OD280，并計算RNA的濃度。按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒進行反轉錄，并以cDNA為模板配制20 μL反應體系進行Real-time PCR。擴增條件為：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。以β-actin為內參，所得CT值按照的2-△△CT方法進行均一化處理后再進行統計學分析。委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因引物的合成。引物序列如下：Sp1：上游5′-GGCAGACTAGCAGCAGCAATACC-3′，下游5′-AGGACAGTTGAGCAGCATTCACAG-3′;Gata4：上游5′-CAGCAGCAGCAGCAGTGAAGAG-3′，下游5′-AGAGCCGACAGCACTGGATGG-3′;TGF-β1：上游5′-GCAACAATTCCTGGCGTTACCTTG-3′，下游5′-TGTATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC-3′;ColⅠ：上游5′-TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG-3′，下游5′-GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCAC-3′;Tsp1：上游5′-GGCTTCATCTTCCTGGCTTCCTTG-3′，下游5′-GCTTCCTCCACTGACACCACTTG-3′;β-actin：上游：5′-TGTGAT GGACTCCGGAGACGG-3′，下游：5′-ACAGCTTC TCTTTGATGTCACGC-3′。

1.2.3.4 Western blot法檢測Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ及Tsp1蛋白表達 按照Protein Extraction Kit試劑盒提取組織總蛋白。取60 μg蛋白樣品100 ℃煮沸變性10 min后，經SDS-PAGE凝膠電泳，按照電流300 mA恒流轉膜2 h至PVDF膜上。隨后將PVDF膜浸泡于Milk Blocking Buffer中，搖床中輕搖1 h，加入抗體Sp1（1∶500）、Gata4（1∶500）、TGF-β1（1∶500）、ColⅠ（1∶500）、Tsp1（1∶500）4 ℃孵育過夜。洗膜后，孵育二抗（1∶5 000）。TBST沖洗，在ECL顯色液中浸泡PVDF膜1 min，于暗室中進行曝光、顯影并定影。以β-actin（1∶3 000）為內參，利用Quantity One v.4.6.2軟件讀取數據。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20統計軟件對所得實驗數據進行分析，結果以均數±標準差（±s）表示，其中符從正態分布的采用單因素方差分析，LSD法用于組間比較，不服從正態分布者用獨立樣本非參數檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織HE染色結果 假手術組可見肌束緊密有序，胞核明顯，形態規則。模型組可見典型的心肌梗死表現，心肌組織被破壞，心肌細胞破碎，細胞核固縮變形，失去原有的結構。扶正化瘀組纖維結締組織減少，大部分胞膜相對完整。見圖1。

2.2 各組大鼠心肌組織Masson染色結果及CVF比較 Masson染色可見胞質染成紫紅色，胞核呈藍紫色，膠原為藍色。與假手術組比較，模型組大鼠CVF增加（P<0.01），膠原大量聚集，纖維化程度較重。與模型組比較，扶正化瘀組CVF減小（P<0.01），膠原相對減少，程度減輕。見圖2、表1。

2.3 各組大鼠心肌組織Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ及Tsp1 mRNA表達比較 與假手術組比較，模型組TGF-β1、ColⅠ及Tsp1 mRNA表達均明顯升高（P<0.05或P<0.01），Gata4 mRNA表達雖有上升趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）;與模型組比較，扶正化瘀組Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ及Tsp1 mRNA表達均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。見表2。

2.4 各組大鼠心肌組織Sp1、Gata4、TGF-β1、ColⅠ及Tsp1表達比較 與假手術組比較，模型組Sp1、Gata4、TGF-β1及ColⅠ表達升高（P<0.01），Tsp1蛋白表達降低（P<0.01）;與模型組比較，扶正化瘀組Gata4、ColⅠ表達降低（P<0.01），Sp1、TGF-β1蛋白表達呈降低趨勢，Tsp1表達呈增高趨勢，但均無統計學意義（P>0.05）。見圖3、表3。

3 討論

心肌梗死的晚期病理學改變中增生的纖維結締組織會替代已壞死的組織，并以膠原沉積的形式影響心肌收縮舒張功能。其臨床表現在中醫學可解釋為正氣虧虛，血瘀阻絡，當以益氣活血化瘀為主，而扶正化瘀膠囊正是以此治則而立。在本實驗中病理染色結果可見，扶正化瘀膠囊可降低CVF，減輕模型大鼠病理狀態，與課題組前期研究發現相吻合[6-7]。

膠原即ECM框架結構的改變可導致纖維化的發生，其中ColⅠ的過度沉積在ECM異常聚集中具有重要作用。TGF-β1可促進ECM中膠原蛋白的合成并抑制其降解，是ECM沉積的促進劑[8]。模型組大鼠心肌組織TGF-β1、ColⅠ及其mRNA表達升高，扶正化瘀膠囊能抑制TGF-β1、ColⅠ及其mRNA的表達，提示扶正化瘀膠囊參與調節TGF-β1、ColⅠ表達減少ECM堆積。

特異性蛋白1（Sp1）相關通路Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1軸是新近發現的與纖維化疾病密切相關的潛在通路，通過調節Sp1和Gata4引發肥大反應，刺激引發心臟成纖維細胞增殖的可溶性因子TGF-β1釋放，上調Tsp1并促進ColⅠ增生，參與ECM的動態調節過程[2]。其中，Sp1是一種細胞外基質蛋白，它可以信號依賴的方式直接與Gata4相互作用以調節基因的表達[9]。Gata4是可直接參與心肌肥厚調節的特定細胞核轉錄因子，是心肌細胞肥大和纖維化的指標[10]，通過加快ColⅠ沉積，促進心肌重塑[11]。Sp1還可直接與ColⅠ啟動子結合[12]，或通過驅動TGF-β1間接激活膠原蛋白Ⅰ啟動子進而促進ColⅠ表達[13]。存在于近端啟動子中的重疊Egr-1和Sp1結合位點共同起作用可以正向調節小鼠Tsp1的組成型表達[14]。Tsp1是一種多功能的ECM糖蛋白[15]，可激活休眠型TGF-β1[16]，TGF-β1也能夠增加其合成[17]，二者相互激活，并促進膠原蛋白增生及細胞凋亡等來影響心臟重塑[18]。本實驗結果顯示，模型組大鼠Sp1、Gata4及其mRNA、Tsp1 mRNA增加，提示Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1軸參與了心梗后左室重構的發生。與模型組比較，扶正化瘀膠囊能夠下調心肌組織Sp1、Gata4表達以及Sp1、Gata4、Tsp1 mRNA的表達，提示其可通過調節Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1軸中Sp1、Gata4、Tsp1的表達，直接或間接減少TGF-β1及ECM膠原合成，改善心梗后心肌重構。

心肌纖維化是心臟重塑的重要病理改變，是心肌梗死患者預后的關鍵所在，因此預防和改善纖維化顯得尤為重要。本實驗結果表明，扶正化瘀膠囊通過降低Sp1、Gata4、Tsp1的表達，可抑制ECM膠原合成，降低CVF，減輕模型大鼠病理狀態，在一定程度上改善心梗后心肌纖維化，其作用機制可能與Sp1-Gata4-ColⅠ-Tsp1軸相關。

參考文獻

[1]Broberg CS，Burchill LJ.Myocardial factor revisited：The importance of myocardial fibrosis in adults with congenital heart disease[J].Int J Cardiol，2015，189：204-210.

[2]Chiasson V，APC T，Guleria RS，et al.Deficiency of MicroRNA miR-1954 Promotes Cardiac Remodeling and Fibrosis[J].J Am Heart Assoc，2019，8（21）：e012880.

[3]Liu C，Hu Y，Xu L，et al.Effect of Fuzheng Huayu formula and its actions against liver fibrosis[J].Chin Med，2009，29（4）：12.

[4]任學嬌，祁軼斐，婁利霞，等.扶正化瘀膠囊對心肌梗死大鼠心肌纖維化及TGF-β1/Smads信號通路的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2018，16（9）：1185-1189.

[5]王碩仁，王振濤，趙明鏡，等.心氣虛病證動物模型及其評價體系的構建[J].中國實驗動物學報，2002，10（1）：33-38.

[6]張冬梅，吳愛明，婁利霞，等.扶正化瘀膠囊對心肌梗死大鼠Rock1、Rock2表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2016，23（9）：74-77.

[7]祁軼斐，任學嬌，婁利霞，等.扶正化瘀膠囊對心肌梗死后心肌纖維化大鼠細胞外基質代謝的影響[J].中醫雜志，2018，59（7）：607-611.

[8]Pardali E，Sanchez-Duffhues G，Gomez-Puerto MC，et al.TGF-β-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases[J].Int J Mol Sci，2017，18（10）：2157.

[9]Flück CE，Miller WL.GATA-4 and GATA-6 modulate tissue-specific transcription of the human gene for P450c17 by direct interaction with Sp1[J].Mol Endocrinol，2004，18（5）：1144-1157.

[10]Kwon DH，Eom GH，Kee HJ，et al.Estrogen-related receptor gamma induces cardiac hypertrophy by activating GATA4[J].J Mol Cell Cardiol，2013，65：88-97.

[11]Zhou C，Cui Q，Su G，et al.MicroRNA-208b Alleviates Post-Infarction Myocardial Fibrosis in a Rat Model by Inhibiting GATA4[J].Med Sci Monit，2016，22：1808-1816.

[12]Ihn H，Tamaki K.Competition analysis of the human alpha2（I）collagen promoter using synthetic oligonucleotides[J].J Invest Dermatol，2000，114（5）：1011-1016.

[13]Cutroneo KR.Human SP1 but not human AP1 binding to the TGF-beta element in the 5′ flanking region of the rat PROalpha1（I）collagen gene[J].Mol Biol Rep，2000，27（3）：191-194.

[14]Shingu T，Bornstein P.Overlapping Egr-1 and Sp1 sites function in the regulation of transcription of the mouse thrombospondin 1 gene[J].J Biol Chem，1994，269（51）：32551-32557.

[15]Cai H，Yuan Z，Fei Q，et al.Investigation of thrombospondin-1 and transforming growth factor-β expression in the heart of aging mice[J].Exp Ther Med，2012，3（3）：433-436.

[16]Murphy-Ullrich JE，Suto MJ.Thrombospondin-1 regulation of latent TGF-β activation：A therapeutic target for fibrotic disease[J].Matrix Biol，2018，68-69：28-43.

[17]Zhang XM，Shi PH，Cao SH，et al.Expression changes of transforming growth factor-beta1 and thrombospondin-1 in cavernous tissues of diabetic rats[J].Urol Int，2010，84（2）：221-225.

[18]Chistiakov DA，Melnichenko AA，Myasoedova VA，et al.Thrombospondins：A Role in Cardiovascular Disease[J].Int J Mol Sci，2017，18（7）：1540.

（2019-10-10收稿 責任編輯：王明）