基于AQP4、Kir4.1及Ras/Raf-1/ERK信號通路和F-ERG探討活血通絡(luò)方對視網(wǎng)膜靜脈阻塞大鼠視網(wǎng)膜功能的影響*

龐 午 楊 榮 刁 科 張 越 楊贊章 李明然 張銘連

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(Retinal vein occlusion，RVO)是臨床上常見的視網(wǎng)膜血管疾病之一，分為中央型及分支型，該病發(fā)病急，病勢重，臨床上以受累靜脈迂曲擴(kuò)張，血流瘀滯，出血、水腫、滲出為主要表現(xiàn)，發(fā)病因素多種，與視網(wǎng)膜炎癥、視網(wǎng)膜低灌注、高血壓、動脈硬化、血液高黏度、血流動力學(xué)異常、外傷等因素有密切關(guān)系[1]。RVO是中醫(yī)眼科治療的優(yōu)勢病種，根據(jù)全身辨證結(jié)合眼局部病情，給予中藥治療，往往能夠獲得較好療效。張銘連教授結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，擬活血通絡(luò)方，調(diào)血通絡(luò)，利水滲濕，主要治療缺血性眼病，且療效顯著[2-4]。本研究以F-ERG和AQP4、Kir4.1及Ras/Raf-1/ERK信號通路為切入點(diǎn)，探討活血通絡(luò)方治療RVO的作用機(jī)制和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料試驗(yàn)材料：大鼠：使用清潔級雄性SD大鼠25只(河北醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動物中心提供)，體質(zhì)量(180±20)g，無眼部疾病。中藥：活血通絡(luò)方由黃芪30 g，當(dāng)歸尾、赤芍各12 g，川芎10 g，桃仁10 g，紅花10 g，水蛭6 g，丹參12 g，葛根30 g，絲瓜絡(luò)10 g，郁金10 g，石菖蒲10 g，澤蘭10 g，茺蔚子15 g，金銀花30 g構(gòu)成。500 ml水浸泡上述藥物4 h，大火煎沸，后改為文火煎至250 ml，按照體表面積計(jì)算法給藥。實(shí)驗(yàn)藥物：4%多聚甲醛(中國，Solarbi公司)，蘇木素染液(中國，Solarbi公司)，伊紅染液(中國，Solarbi公司)，AQP4抗體、Kir4.1抗體、p-Erk1/2抗體、Ras抗體、p-Raf-1抗體(美國，Abcam公司),β-actin抗體(中國，博士德公司)，生物素標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(中國，博士德公司)，眼前節(jié)照相機(jī)(日本，佳能)，電生理儀(美國，羅蘭，RETIport32)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組將大鼠隨機(jī)分為3組，實(shí)驗(yàn)對照組5只，給予左眼視網(wǎng)膜光凝封閉分支靜脈，術(shù)后給予生理鹽水2 ml/d，灌胃；中藥實(shí)驗(yàn)組5只，光凝術(shù)式同實(shí)驗(yàn)對照組，術(shù)后給予活血利水通絡(luò)方2 ml/d，灌胃。正常空白對照組5只，未予光凝造模。

1.2.2 視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞模型制作10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔麻醉大鼠，全麻滿意后，復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴左眼以散瞳，尾靜脈注射3%孟加拉紅注射液40 mg/kg(配置方法：孟加拉紅0.3 g，溶解于10 ml生理鹽水中，充分溶解后，通過一次性針頭過濾器過濾以滅菌)。5 min后丁卡因滴眼液對大鼠左眼表面麻醉，隨后覆蓋蓋玻片以觀察眼底。以左眼為實(shí)驗(yàn)眼，右眼為對照眼。而后將大鼠置于激光器前，選擇一支距視盤約1PD距離，與動脈較遠(yuǎn)的視網(wǎng)膜靜脈進(jìn)行激光照射，激光參數(shù)：532 nm波長綠光，能量 100 mW，光斑直徑50 μm，曝光時(shí)間0.2 s，激光點(diǎn)數(shù)80～125次，待激光處靜脈呈變細(xì)，血流中斷，遠(yuǎn)端血管充盈迂曲時(shí)，改用85 mW能量補(bǔ)充激光若干點(diǎn)以鞏固效果[5]，第2天行眼底血管造影確定造模成功。見圖1。

注：(a)圖箭頭處為視網(wǎng)膜靜阻病變處，靜脈血流中斷，周圍視網(wǎng)膜水腫、出血。(b)圖顯示FFA檢查35 s時(shí)靜脈回流受阻，提示視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞造模成功圖1 視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞造模

1.2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠視網(wǎng)膜F-ERG b波檢測經(jīng)造模實(shí)驗(yàn)大鼠均在視網(wǎng)膜激光前行F-ERG檢測，造模成功后，于術(shù)后第3天、第6天再次行F-ERG檢測。大鼠暗適應(yīng)30 min后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，復(fù)方托吡卡胺點(diǎn)眼散大瞳孔，丁卡因滴眼液點(diǎn)眼表麻角膜，固定大鼠于水浴平臺上，安置電極，作用電極盡量與角膜產(chǎn)生最大接觸，參考電極置于耳后，地電極置于尾根部，整個(gè)操作過程在暗紅光下進(jìn)行。操作時(shí)白光閃爍，具體參數(shù)：白光閃爍全視野反應(yīng)持續(xù)10 ms，閃光強(qiáng)度10.02 cd/(m2·c)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)至少檢查3次，記錄b波振幅值。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)大鼠視網(wǎng)膜相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測經(jīng)實(shí)驗(yàn)大鼠(空白對照組及成功造模后大鼠)過量麻醉處死，迅速摘除實(shí)驗(yàn)眼球，置于冰浴中，依次去除角膜、虹膜、晶狀體及玻璃體，獲取視網(wǎng)膜后迅速放入液氮罐中，后置于-80 ℃冰箱保存。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測樣本蛋白濃度，按Westernblot試驗(yàn)步驟分別檢測AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白((-actin)對應(yīng)灰度值的比值計(jì)算蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析， 計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活血利水通絡(luò)方對大鼠視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞F-ERG的影響各組造模前ERG b波振幅進(jìn)行兩兩比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。造模后2組b波振幅較造模前均下降，與術(shù)前比較具有顯著性差異(P<0.01)。中藥實(shí)驗(yàn)組造模后第3天、第6天的b波振幅相對于實(shí)驗(yàn)對照組恢復(fù)較好，且第6天時(shí)恢復(fù)明顯好于實(shí)驗(yàn)對照組，且趨于正常，在各時(shí)間與實(shí)驗(yàn)對照組比較差異有顯著性意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞模式大鼠視網(wǎng)膜F-ERG b波波幅比較 (只，

2.2 Western-blot檢測AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-Erk1/2蛋白的表達(dá)AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-Erk1/2在正常視網(wǎng)膜具有表達(dá)，成功造模后第6天取材，實(shí)驗(yàn)對照組的AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-Erk1/2水平與空白對照組比較，P<0.01；中醫(yī)實(shí)驗(yàn)組的AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-Erk1/2水平與實(shí)驗(yàn)對照組比較，P<0.01。見表2、圖2、圖3。

表2 3組大鼠視網(wǎng)膜中AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf-1、p-Erk1/2的表達(dá) (只，

注：A為空白對照組，B為實(shí)驗(yàn)對照組，C為中藥實(shí)驗(yàn)組圖2 不同組各檢測蛋白的表達(dá)比較

3 討論

眼為竅穴，內(nèi)涵脈絡(luò)。視網(wǎng)膜靜脈為目中絡(luò)脈的一部分，具有滲灌氣血、發(fā)越神光的作用。RVO是目絡(luò)急病之一，在中醫(yī)上分屬于“絡(luò)損暴盲”“視瞻昏渺”范疇，該病的主要病機(jī)是目絡(luò)瘀阻，血溢脈外[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血水同源[7]，且相互轉(zhuǎn)化，生理上，唐容川《血證論》指出 “血與水皆陰也”“水為血之倡，氣行則水行，水行則血行”。在病理上，《金匱要略》言：“經(jīng)為血，血不利則為水”，《血證論》則強(qiáng)調(diào)了“血病而不離乎水”“水病而不離乎血”的病理關(guān)系。因此在治療上，要求水血同治。

注：(a)至(e)依次為AQP4、Kir4.1、Ras、p-Raf1、p-Erk1/2的條形圖圖3 檢測目的蛋白表達(dá)的條形圖

張銘連教授提出了目絡(luò)學(xué)說[8，9]，認(rèn)為目絡(luò)疾病的病因以熱、毒、痰、濕、郁、瘀、虛為主，而目絡(luò)瘀阻是其主要病機(jī)。RVO會造成視網(wǎng)膜組織的缺血缺氧，從而引起視網(wǎng)膜屏障破壞，引起的視網(wǎng)膜出血、水腫[10]。因此在治療上，主張以調(diào)血通絡(luò)為主要治則，兼以利水滲濕，并自擬活血通絡(luò)方，奏活血通脈利水之效。方中應(yīng)用黃芪，一可滋補(bǔ)元?dú)猓芍醒辛Γ怀嗌帧⒋ㄜ骸?dāng)歸尾、丹參配伍桃仁、紅花，可活血散瘀，行氣通絡(luò)，再配合絲瓜絡(luò)、水蛭，可增通絡(luò)化瘀之效；葛根、郁金、石菖蒲，宣揚(yáng)氣機(jī)，醒腦開竅；澤蘭、茺蔚子相用，可活血利水消腫，諸藥合用，相得益彰，共奏益氣活血、化瘀通絡(luò)之功。

RVO造成血-視網(wǎng)膜屏障破壞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞外水腫，血管內(nèi)血漿滲漏到神經(jīng)上皮層內(nèi)，視網(wǎng)膜呈灰白色水腫[11，12]。Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜主要的膠質(zhì)細(xì)胞，貫穿整個(gè)視網(wǎng)膜，參與血-視網(wǎng)膜屏障的建立，維持視網(wǎng)膜胞外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，和視網(wǎng)膜組織中的離子和水的穩(wěn)態(tài)。液體吸收是通過水通道蛋白通過膜內(nèi)水傳遞介導(dǎo)的，這些水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn)跨膜的水流雙向運(yùn)動。AQP4在Müller細(xì)胞上表達(dá)最為豐富。而細(xì)胞膜表達(dá)多種鉀離子通道蛋白，其中與水轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的主要是Kir4.1。任何影響AQP4與鉀通道通透性的因素，均可以造成視網(wǎng)膜水的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，導(dǎo)致Müller細(xì)胞腫脹、視網(wǎng)膜組織水腫[13]。

本研究應(yīng)用活血通絡(luò)方治療視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞實(shí)驗(yàn)，通過中藥活血通絡(luò)散瘀之效，奏利水消腫明目之功。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，通過應(yīng)用活血通絡(luò)方治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞大鼠后，AQP4、Kir4.1的表達(dá)均低于實(shí)驗(yàn)對照組(P<0.01)。這種差異表明AQP4、Kir4.1抑制了視網(wǎng)膜水腫的加重，對視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用，具有目絡(luò)再通、水濕消退功效，維持視網(wǎng)膜功能作用。

視網(wǎng)膜靜脈阻塞發(fā)生后，視網(wǎng)膜組織產(chǎn)生缺血缺氧環(huán)境，缺氧的環(huán)境直接誘導(dǎo)VEGF因子的表達(dá)增多[14]，而VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的促有絲分裂素，正常生理水平的VEGF能夠維持視網(wǎng)膜血管的穩(wěn)定性，但因病理情況引起的VEGF過度表達(dá)會促進(jìn)血管的異常增殖，同時(shí)增加血管的滲透性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫、出血[15]。 Ras/Raf-1/ERK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族中重要的成員之一，是一個(gè)蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)，是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、生存和凋亡的重要途徑[16，17]。Ras/Raf-1/ERK是VEGF的下游信號，參與VEGF表達(dá)變化的調(diào)控。Ras在信號通路中處于中樞地位，當(dāng)Ras受到細(xì)胞外信號刺激后，繼而激活Raf-1，進(jìn)一步磷酸化ERK1/2，產(chǎn)生一系列效應(yīng)酶，從而調(diào)控細(xì)胞應(yīng)答，影響血管生成的發(fā)生、發(fā)展過程[18]。在視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞的條件下，Ras、p-Raf-1及p-ERK1/2表達(dá)均升高，但是應(yīng)用活血通絡(luò)方后，中藥實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對照組對比，Ras、p-Raf-1及p-ERK1/2的表達(dá)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示活血通絡(luò)方能夠抑制RVO發(fā)生后VEGF增多，改善視網(wǎng)膜缺血、缺氧、水腫情況。

F-ERG b波集中反應(yīng)了視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞和Müller細(xì)胞的電活動，視網(wǎng)膜內(nèi)層組織，特別是顆粒細(xì)胞層參與了b波的形成[19]。a波來自光感受器層，它主要反映視網(wǎng)膜光感受器的電位變化[20]。當(dāng)視網(wǎng)膜缺血損傷發(fā)生時(shí)，首先影響b波，b波組織對缺血的影響比產(chǎn)生a波的組織更明顯[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：在視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞條件下，應(yīng)用活血通絡(luò)方的大鼠視網(wǎng)膜b波恢復(fù)在術(shù)后第3天、第6天時(shí)均較實(shí)驗(yàn)對照組有明顯提升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示應(yīng)用活血通絡(luò)方后，受累的靜脈周圍視網(wǎng)膜組織功能能夠得到有效的恢復(fù)。

由此可見，在視網(wǎng)膜靜脈阻塞條件下，活血通絡(luò)方能夠抑制AQP4、Kir4.1的表達(dá)，調(diào)控Ras/Raf-1/ERK信號通路，抑制VEGF的表達(dá)，保護(hù)視網(wǎng)膜功能，改善視網(wǎng)膜缺血缺氧環(huán)境，證實(shí)了活血通絡(luò)方治療視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞的有效性，值得在臨床中大力推廣和應(yīng)用。