敗醬草總黃酮部位體外抗病毒活性成分研究

王文琪，李媛媛，王雙，朱彥軍，孫夢佳，蔡馥潔，孫曉慧，柳晴，周洪雷

(山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

敗醬草(Patrinia Herb)是敗醬科植物白花敗醬、黃花敗醬的全草，黃花敗醬為主要品種，又名龍芽敗醬、黃花龍牙、苦菜、鹿腸等，始載于《神農本草經》，中醫認為敗醬草味辛、苦，性涼，入胃、大腸、肝經，有清熱解毒，消癰排膿，活血行瘀和抗病毒的功效，用于治療肺癰、腸癰、癰腫瘡毒以及赤白帶下，產后瘀阻腹痛等[1]。

目前，已證實敗醬草水提液對呼吸道合胞病毒(RSV)具有顯著抑制作用[2]。現在治療病毒性疾病的大多為干擾素及核苷類藥物，存在副作用大、易反復、耐藥性顯著、價格昂貴且療程長等不足。而中藥對病毒具有多重作用，毒副作用小，很少產生耐藥性，能增強機體免疫功能，具有較為顯著的優勢。

敗醬草為我國傳統中藥，在國內南北各地均有分布，其有效成分主要為黃酮、三萜皂苷、環烯醚萜、揮發油、甾醇、香豆素、木脂素等[3]，近年來研究發現該藥具有廣泛的藥理作用和很高的臨床藥用價值[4]。

譚超等[5]發現黃花敗醬草的蒸餾液部位在體外對大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性較強，而醇提部位的抑菌活性不高。Xu等[6]發現敗醬草水提部位有明顯的抗HIV病毒活性。但敗醬草總黃酮部位的具體抗病毒活性成分的報道并不多見。本文采用細胞病變法對敗醬草總黃酮部位進行體外抗病毒活性篩選，并通過LC-MS對其活性成分進行定性分析，為敗醬草抗病毒活性的深入研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CO2恒溫培養箱(日本SANYO)；生物安全柜(濟南鑫貝西公司)；酶標儀，四級桿-靜電場軌道阱超高分辨質譜儀，UltiMate3000 超高相液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 材料

細胞株：非洲綠猴腎細胞(vero)(RSV、HSV-1敏感細胞)、橫紋肌瘤細胞(RD)(EV-71敏感細胞)來自山東省醫學科學院基礎醫學院研究所微生物室。

病毒株：呼吸道合胞病毒(RSV)、腸道 EV-71 病毒(EV-71)、單純皰疹 I 型病毒(HSV-1)來自中國疾病預防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室。

對照品：綠原酸(批號：161146-160831)、咖啡酸(批號：161181-161020)、木犀草苷(批號：161165-160918)(江蘇永健醫藥科技有限公司)；山奈素(批號：S24N7D25625)、槲皮素(批號：C20J6Y1722)、山奈酚(批號：C26J8Y38642)(上海源葉科技有限公司)；蘆丁(批號：BCY-000507，江西佰草源生物科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

取敗醬草50 g粉碎，6倍量石油醚(沸程60～90 ℃)回流脫脂(2次，每次1 h)，12倍量水85 ℃條件下溫浸(3次，每次2 h)，合并藥液，過濾濃縮。水提液中加入1/4倍量的Sevag試劑，劇烈振搖30 min，3000 r/min離心10 min，棄下層有機相。上清液濃縮至50 mL，加入體積分數95%乙醇，邊加邊攪拌，至醇含量達80%，冷藏靜置12 h后抽濾。將醇沉上清液部位以水溶解至0.5 g/mL，用0.1 mol/L的HCL調pH至4.2，抽濾，濾液上D101大孔吸附樹脂柱，靜置吸附12 h，然后依次用蒸餾水，10%、30%、50%的乙醇梯度洗脫，每個梯度洗脫4 BV，流速為4 BV/h，洗脫液濃縮干燥，得各梯度洗脫部位。

2.2 體外抗病毒活性部位的篩選

2.2.1 細胞復蘇與傳代

2.2.2 藥物體外抗病毒實驗

將樣品用細胞維持液以2倍比做系列稀釋(2-11～20)，共12個濃度，依次加入96孔板內的單層宿主細胞上(100 μL/孔)，并加100TCID50的病毒(100 μL/孔)，同時設病毒對照組、正常細胞對照組。于35 ℃、體積分數5% CO2中培養，待病毒對照組細胞病變效應(CPE)達90%時所有實驗組終止培養。將96孔板里的細胞培養液拍出，加中性紅染液(100 μL/孔)，35 ℃、5% CO2培養1 h后倒出染液，小水流沖洗3～5次后甩干，加脫色液(100 μL/孔)，37 ℃、5% CO2培養15 min，用酶標儀在540 nm處測定其吸光度值(OD值)，結合Reed-Muench 公式[7]：細胞比距=(高于50% 病變率-50%)/(高于50% 病變率-低于50% 病變率)×100%，計算治療指數(TI)值(TI=TC50/EC50)，同時用電子顯微鏡觀察。結果見表 1。

表1 敗醬草各部位抗病毒篩選結果Table 1 Antiviral screening results of various parts of Patrinia Herb

2.3 抗病毒有效部位的LC-MS分析

2.3.1 測定條件

2.3.1.1 液相條件

色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：45 ℃；進樣溫度：15 ℃；進樣量5 μL；梯度洗脫，流動相A為水(含0.05%甲酸)，流動相B為乙腈，梯度洗脫：0～10 min，5%～23% B；10～12 min，23%～45% B；12～25 min，45%～46% B；25～28 min，46%～100% B。

2.3.1.2 質譜條件

采用負離子模式檢測；采集范圍100～1000m/z；分辨率70 000 HESI；離子源；毛細管溫度300 ℃，電壓3500 V；源內溫度350 ℃；鞘氣45，輔氣10；S-Lens RF Level：55。

2.3.2 樣品溶液的制備

精密稱取30%乙醇洗脫部位20 mg，置25 mL容量瓶中，以80%甲醇溶解后定容，而后以0.22 μm微孔濾膜過濾，得樣品溶液。

2.3.3 LC-MS分析

按2.3.2項下方法制備樣品溶液，在2.3.1項下LC-MS條件進樣分析，得到總離子流圖(圖1)，同時進行高分辨二級掃描，得到負離子模式下不同化合物的高分辨二級質譜信息(圖2)。對圖1提供的保留時間和圖2提供的典型碎片離子峰進行分析，并通過與對照品對比鑒定，共鑒定出14個化合物(表2)。

圖1 敗醬草總黃酮部位的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of total flavonoids in Patrinia Herb

表2 敗醬草總黃酮30%乙醇洗脫部位中14種成分鑒別分析結果Table 2 Results of the identification and analysis of 14 components of total flavonoids eluted by 30% ethanol of Patrinia Herb

2.3.3.1 化合物1

tR=4.02 min，m/z353.087 86 [M-H]-，根據m/z191.055 08，152.038 74等綠原酸典型碎片離子峰，經與對照品對比鑒定為綠原酸(圖2)。

2.3.3.2 化合物2

tR=4.65 min，m/z179.033 97 [M-H]-，根據m/z135.043 75，112.984 06等咖啡酸的典型碎片離子峰，經與對照品對比鑒定為咖啡酸(圖2)。

2.3.3.3 化合物3

tR=6.81 min，m/z563.140 99 [M-H]-，在二級質譜圖中發現m/z545.132 93，503.121 55，473.109 25，443.098 42，383.077 45，353.067 05等碎片離子峰，m/z563.140 99脫水得到m/z545.132 93，m/z563.140 99糖鏈裂解丟失C2H4O2得到m/z503.121 55，m/z563.140 99糖鏈裂解丟失C3H6O3得到m/z473.109 25，m/z563.140 99糖鏈裂解丟失C4H8O4得到m/z443.098 42，m/z563.140 99糖鏈裂解連續丟失C2H4O2和C4H8O4得到m/z 383.077 45，m/z563.140 99糖鏈裂解連續丟失C3H6O3和C4H8O4得到m/z353.067 05，因此推測為夏佛塔苷(圖2)。

2.3.3.4 化合物4

tR=8.03 min，m/z609.146 30 [M-H]-，另外二級質譜圖中存在300.035 52，179.033 81，151.038 83等碎片離子峰，m/z300.999 18為苷元離子峰，m/z179.033 81、151.038 83為苷元離子發生逆-狄爾斯-阿爾德反應得到，經與對照品對比鑒定為蘆丁(圖2)。

2.3.3.5 化合物5

tR=8.53 min，m/z447.093 48 [M-H]-，另外二級質譜圖中存在327.050 84，285.040 50，133.028 11等碎片離子峰，[M-H]-峰發生糖鏈裂解失去C4H8O4得到m/z327.050 84，m/z285.040 50為苷元離子峰，苷元離子發生逆-狄爾斯-阿爾德反應得到m/z133.028 11，因此推測為木犀草素-6-C-葡萄糖苷(圖2)。

2.3.3.6 化合物6

tR=8.42 min，m/z447.093 51 [M-H]-，另外二級質譜圖中存在285.040 50，257.044 49等碎片離子峰，其中m/z285.040 50為苷元離子峰，而后失去一分子CO得到m/z257.044 49，經與對照品對比鑒定為木犀草苷(圖2)。

2.3.3.7 化合物7

tR=12.18 min，m/z285.040 47 [M-H]-，另外二級質譜圖中存在257.044 65，151.002 32，133.027 98，107.012 25等典型碎片離子峰，其中m/z257.044 65由苷元離子失去一個H和CO得到，m/z151.002 32，133.027 98，107.012 25為苷元發生逆-狄爾斯-阿爾德反應產生，因此推測為木犀草素(圖2)。

2.3.3.8 化合物8

tR=12.25 min，m/z301.035 46 [M-H]-，另外二級質譜圖中存在273.040 71，178.997 53，151.002 35，107.012 25等典型碎片離子峰，m/z273.040 71為[M-H]-峰失去CO得到，m/z178.997 53，151.002 35，107.012 25為苷元發生逆-狄爾斯-阿爾德反應產生，經與對照品對比鑒定為槲皮素(圖2)。

2.3.3.9 化合物9

tR=12.83 min，m/z269.045 53 [M-H]-，二級質譜圖中發現227.034 01，225.055 13，201.054 93，183.044 04，151.002 40，117.033 01，107.012 27等碎片離子峰，[M-H]-峰發生C環裂解生成m/z151.002 40，117.033 01，107.012 27，m/z227.034 01，225.055 13，201.054 93分別由[M-H]-峰失去一分子C2H2O，CO2以及C3O2得到，[M-H]-峰連續失去C2H2O和CO2得到m/z183.044 04，因此推測為芹菜素(圖2)。

2.3.3.10 化合物10

tR=12.97 min，m/z285.040 68 [M-H]-，二級質譜圖中發現267.160 37，255.160 31，227.128 27，211.133 36，133.012 91等碎片離子峰，[M-H]-峰發生C環裂解生成m/z133.012 91，m/z267.160 37，255.160 31分別由m/z285.040 68失去一分子H2O和OCH2得到，m/z255.160 31失去CO得到m/z227.128 27，m/z255.160 31失去CO2得到m/z211.133 36，經與對照品對比鑒定為山奈酚(圖2)。

2.3.3.11 化合物11

tR=13.05 min，m/z315.050 93 [M-H]-，另外二級質譜圖中存在300.027 50，283.025 27，271.024 78，255.029 74，227.034 38，216.042 53，164.010 21，151.002 40，148.015 29，107.012 23等碎片離子峰，[M-H]-峰失去一分子CH3得到m/z300.027 50，m/z300.027 50失去一分子COH得到m/z271.024 78，m/z300.02750失去一分子CO2H得到m/z255.029 74，m/z255.029 74失去一分子CO得到m/z227.034 38，m/z300.027 50發生C環裂解生成m/z164.010 21，151.002 40，148.015 29，107.012 23，因此推測為異鼠李素(圖2)。

2.3.3.12 化合物12

tR=13.35 min，m/z255.102 49 [M-H]-，另外二級質譜圖中存在135.043 72，118.997 07等碎片離子峰，為發生逆-狄爾斯-阿爾德反應產生的甘草素的典型碎片離子峰，因此推測為甘草素(圖2)。

2.3.3.13 化合物13

tR=14.76 min，m/z299.056 12 [M-H]-，另外二級質譜圖中存在284.032 65，256.031 45，227.034 23，151.002 41，107.012 28等碎片離子峰，[M-H]-峰失去一分子CH3得到m/z284.032 65，m/z284.032 65失去一分子CO得到m/z256.031 45，m/z256.031 45失去一分子COH得到m/z227.034 23，m/z284.032 65發生C環裂解生成m/z151.002 41，107.012 28，因此推測為香葉木素(圖2)。

2.3.3.14 化合物14

tR=14.89 min，m/z299.056 15[M-H]-，另外二級質譜圖中存在m/z599.107 06，這是[2M-H]-的信號峰，經與對照品對比鑒定為山奈素(圖2)。

圖2 化合物1～14的二級質譜圖Fig.2 Secondary mass spectrum of compound 1～14

續圖2

3 討論

本研究選擇了EV-71，HSV-1，RSV三種病毒株來檢測敗醬草總黃酮部位抗病毒活性。其中EV-71感染會導致手足口病、腦炎、腦膜炎、口腔炎、咽炎、出疹性疾病、肌病等，嚴重者可造成死亡，已經成為我國兒童常見的感染疾病，但目前尚無有效治療EV71感染的藥物上市[8]；HSV-1感染能引起口腔及生殖器黏膜產生皰疹和潰瘍，嚴重者可引發腦炎[9]；RSV是嬰幼兒、老年人和免疫功能低下者誘發下呼吸道感染的主要原因[10]。另外這三種病毒的發病癥狀均為溫病癥狀，溫病多為急性外感疾病，發病急，變化快，變證多，研究溫病對病毒研究有十分重要的作用[11]。

本研究結果顯示敗醬草總黃酮30%乙醇洗脫部位對EV-71以及HSV-1病毒都具有顯著的抑制作用，對其活性成分進行LC-MS定性分析鑒定出14個化合物，即為綠原酸、咖啡酸、夏佛塔苷、蘆丁、木犀草素-6-C-葡萄糖苷、木犀草苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素、甘草素、香葉木素、山奈素，這些活性成分的進一步抗病毒活性評價有待后續研究。