中性和石灰性土壤有效磷測定的影響因素

李金娟

（甘肅省農業科學院畜草與綠色農業研究所（甘肅省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所），甘肅蘭州 730070）

磷是植物體內含量僅次于氮和鉀的元素，也是作物生長不可或缺的營養元素。土壤有效磷是土壤中能夠被植物吸收利用的磷，其含量的高低極大程度上反映了土壤中磷元素的儲備量和供應力，是判斷土壤肥力的一個重要指標。準確測定土壤中有效磷養分含量，了解其供應狀況，是保證作物高產、優質、高效、精確施肥量的最基礎和最關鍵環節，對提高作物產量具有重要參考價值[1]。常規土壤養分測定中，中性和石灰性土壤中有效磷的提取和測定較為復雜，涉及的影響因素較多，同一土壤由于測定條件不同往往測定結果不同[2]。而目前的研究針對中性和石灰性土壤有效磷測定條件控制的研究較少[3-5]。因此，本研究以LY/T 1232-2015《森林土壤磷的測定》中的碳酸氫鈉浸提- 鉬銻抗比色法為標準方法，以實驗室標準物質為質控樣，通過磷標準曲線標定、浸提劑pH 值、是否添加活性炭、提取溫度、顯色時間5 個方面進行試驗，獲得相應的質控方法，以此探索提高土壤有效磷檢測結果準確性的路徑，優化其檢測方法，提高土壤有效磷測定的準確性，從而提高土壤有效磷的檢測效率，為土壤施肥技術和作物產量提高等提供充足的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料 質控樣分別為來源于中國地質科學院地球物理地球化學勘查研究所的三種標準物質，見表1。

表1 三種標準物質（質控樣）信息

使用的儀器分別為JM-B10002 型分析天平，感量為0.01 g； Cary50 紫外分光光度計，可在880 nm 波長處測讀吸光度；國華CHA-S 氣浴恒溫振蕩器；精密酸度計。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 0.5 moL/L 碳酸氫鈉（pH=8.5） 浸提劑配制：稱取3 份42.0 g 碳酸氫鈉（NaHCO3），分別加蒸餾水至近1 L，分別用2 moL/L 氫氧化鈉溶液調pH 值為8.0、8.5、9.0，然后分別定容至1 L，貯存于聚乙烯瓶或玻璃瓶中備用。

酒石酸銻鉀溶液（0.3%）配制：稱取酒石酸銻鉀0.30 g溶于100 mL 水中。

鉬銻貯備液配制：稱取鉬酸銨10.0 g 溶于約60℃的 300 mL 水中，冷卻。量取濃硫酸181 mL，邊攪拌邊緩緩倒入鉬酸銨溶液中，再加入提前配制好的0.3% 的酒石酸銻鉀溶液，冷卻后用蒸餾水定容至1 L，搖勻貯存于棕色試劑 瓶中。

鉬銻抗顯色液配制：稱取0.5 g 抗壞血酸溶于100 mL鉬銻貯備液中，現配現用。

1.2.2 磷標準曲線繪制 分別吸取5 μg/mL 的磷標準溶液0.00、1.50、2.50、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 mL于8 支50 mL 容量瓶中，分別加入10.00 mL 碳酸氫鈉提取劑和5 mL 鉬銻抗顯色液，用蒸餾水稀釋定容至刻度，搖勻，分別在20℃、25℃、30℃三個溫度梯度下顯色30 min（溫度由恒溫振蕩器設置控制溫度）。顯色環境和溫度根據實際試驗過程中的結果進行調整。然后以上述標準系列溶液的磷濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制曲線，計算回歸方程。

1.2.3 土壤有效磷的測定 分別稱取2.50 g 三種質控標準物質于干燥塑料浸提瓶中，每個質控樣稱取三份，分別加入pH 值 為8.0、8.5、9.0 的0.5 moL/L 碳 酸 氫 鈉 浸 提 劑 50.0 mL，用塑料蓋蓋緊，于20℃、25℃、30℃三個溫度梯度下的恒溫振蕩器上振蕩（30±1）min，然后用無磷濾紙過濾入試管中，作是否添加活性炭的對照。在浸提當天，吸取過濾液10 mL 于干燥的50 mL 容量瓶中，加入1 滴2，4-二硝基酚指示劑，用硫酸及氫氧化鈉溶液將溶液pH 值調至剛呈微黃色，再緩慢加入鉬銻抗顯色劑5.00 mL，加液同時搖動瓶身以排出二氧化碳氣體，之后充分搖勻并用蒸餾水定容。分別在20℃、25℃、30℃三個溫度梯度下顯色30 min（溫度由恒溫振蕩器設置控制溫度）后，在880 nm 波長處比色，測吸光度。以空白溶液（10.00 mL 浸提劑代替土壤濾出液，同上處理）為參比液，調節分光光度計的零點。同時作空白對照。

1.2.4 結果計算 相關計算公式如下：

其中，WP為有效磷含量（mg/kg），C為從工作曲線上查得顯色液的磷濃度（μg/mL），V為顯色液體積， 50 mL，ts為分取倍數；K2為由風干土樣換算成烘干土樣的水分換算系數，m1為風干土樣質量（g）。

2 結果與討論

2.1 有效磷標準曲線的影響因素 本研究選取了20、25、30℃三個顯色環境溫度分別進行磷標準溶液的顯色反應，結果如表2 所示。有效磷標準曲線的R2值必須大于或等于0.999 0 才為合格，方可用于有效磷的測定。在恒溫振蕩器恒溫顯色環境中，顯色反應在20℃時，試驗中觀察到低濃度點的標準溶液幾乎不顯色，標準曲線的相關系數遠遠達不到0.999 0以上，標準曲線不合格。顯色反應在25℃時，低濃度點標準溶液幾乎不顯色，標準曲線相關系數勉強達到了0.999 0 以上。而在30℃時，加入顯色劑顯色30 min 后可以明顯觀察到各個濃度點標準溶液均呈現不同深淺的藍色，且高濃度點的藍色顯著深于20℃和25℃處理的，對各個點計算標準方程后發現，此條件下的標準曲線合格，相關系數R2遠高于0.999 0，達到了0.999 9，標準曲線理想。以上結果表明，隨著顯色環境溫度的升高，顯色反應顯色越充分，標準曲線相關系數R2值越高，標準曲線也越理想。30℃顯色環境溫度下，標準溶液顯色最為充分，標準曲線相關系數R2達到了0.999 9，逼近于最高值1，有效磷標準曲線最為理想。

表2 不同顯色條件對有效磷標準曲線的影響

2.2 浸提劑pH 值對土壤有效磷測定的影響 實驗室實際檢測工作中，碳酸氫鈉浸提劑的pH 值往往會隨著存放時間的增加而增加，成為影響土壤有效磷測定的一個重要因素。本研究選取了三個不同pH 值的碳酸氫鈉溶液作為浸提劑，分別對表1 所示的三個質控樣品進行有效磷的測定。結果如表3 所示，隨著碳酸氫鈉浸提劑pH 值的升高，土壤有效磷的測定值也在升高。對比三種pH 值浸提劑提取的有效磷測定值，同一標準物質，當碳酸氫鈉浸提劑pH 值為8.5 時，有效磷測定值最接近于標準物質的認定值，說明在土壤有效磷測定過程中，碳酸氫鈉浸提劑需要現配現用或者將浸提劑的pH 值調至8.5 保存。

2.3 活性炭對土壤有效磷測定的影響 本研究為探測活性炭在土壤有效磷檢測中是否必要，選取同一質控樣品GBW07413a（ASA-2a），在相同試驗條件下，以是否在浸提液中加入活性炭為變量，對該樣品進行了5 次檢測，結果如表4 所示。添加活性炭后，質控樣品有效磷含量對比未添加活性炭后含量，結果均在認定值質控范圍內，且結果中有效磷含量增加的3 次，減少的2 次，無明顯規律。說明是否添加活性炭對土壤有效磷測定的影響較小，可以忽略不計。

2.4 提取溫度對土壤有效磷測定的影響 本研究選取了早春（15℃）、初夏（25℃）、盛夏（30℃）三個不同提取溫度下，對表1 中三個質控樣品提取的有效磷含量進行分析，如表5所示。結果表明，三個不同的質控樣品，在15、25、30℃三個提取溫度下，有效磷含量的測定結果均統一呈現出隨著提取溫度的升高而增加。說明提取溫度對土壤有效磷含量的測定影響較大，且三個不同有效磷含量的質控樣均在25℃提取溫度下最接近于認定值。因此，在實驗室實際檢測工作中，需要對提取溫度進行嚴格控制，震蕩提取時需要在設定恒溫下進行，以保證有效磷檢測數據的準確性，以提取溫度25℃為最優。

2.5 顯色時間對土壤有效磷測定的影響 本研究對鉬銻抗顯色25、30、35 min 三個不同顯色時間下三個質控樣品提取的有效磷含量進行分析，如表6 所示。結果表明，隨著顯色時間的增加，有效磷含量測定結果均統一呈現出隨著顯色時間的延長而增加。說明顯色時間對土壤有效磷含量的測定有顯著影響，且三個不同有效磷含量的質控樣均在顯色反應進行30 min 時測定的結果接近于認定值。因此，在實驗室進行土壤有效磷含量測定時一定要控制好加入鉬銻抗顯色液后的顯色反應時間，以保證有效磷檢測數據的準確性，以顯色反應30 min 為最優。

表3 不同pH 值浸提劑對土壤有效磷測定的影響

表4 是否添加活性炭對土壤有效磷測定的影響

表5 提取溫度對土壤有效磷測定的影響

表6 顯色時間對土壤有效磷測定的影響

3 結論與討論

中性和石灰性土壤有效磷含量的測定要保證測定數據的準確性。首先，磷標準曲線的正確標定繪制至關重要，直接關系到有效磷測定結果的可靠性。其次，要保證碳酸氫鈉浸提劑的pH 值在8.5。整個提取過程中，要保證震蕩提取的溫度在25℃±1。另外，顯色時間必須控制在30 min。除此之外，添加鉬銻抗顯色液時會生成大量氣泡，加液時應注意邊搖邊加液，盡量使氣泡排除，避免在比色時因讀數不穩定而影響結果的準確度。

LY/T 1232-2015《森林土壤磷的測定》注明要添加活性炭以吸附消除提取液中的顏色干擾，但此操作步驟煩瑣，還會帶來二次污染，且本研究表明活性炭的添加與否對土壤有效磷測定的結果影響不大，因此實際檢測中常省略這一步驟。有研究表明在880 nm 波長下測定的有效磷效果更好[6]，因此實驗室有效磷檢測中推薦使用880 nm 波長進行測定。