枯芩與子芩醇提物對LPS 誘導的急性肺損傷保護作用比較研究

胡江慧 劉艷菊 張方蕾? 許 靜 林 雄 朱天翔

（1.湖北中醫藥大學藥學院， 湖北 武漢430065； 2.湖北省中藥炮制工程技術研究中心， 湖北 武漢430065）

黃芩是唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根［1］，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，且具有抗炎、抗菌等多種藥理作用，臨床常用于治療急性感染性疾病。研究發現，黃芩水提取物對脂多糖（LPS）所致ALI 大鼠具有保護作用［2?3］。黃芩首載于《神農本草經》［4］，分為子芩和枯芩。子芩質地堅實，枯芩質輕腐朽。據古籍記載子芩瀉下焦大腸之火，枯芩善清上焦肺胃之熱。目前市場上已不區分子芩和枯芩，統稱黃芩。對兩種規格飲片的藥效差異課題組前期進行了研究。實驗結果［5］表明，體外實驗提示子芩與枯芩對肺炎鏈球菌有抑菌作用，體內實驗表明兩種飲片對肺炎模型大鼠有較好治療作用，且枯芩明顯優于子芩，初步明確兩飲片的藥效差異。為了進一步驗證枯芩與子芩對上焦肺經的藥效作用差異，擬以急性肺損傷小鼠為模型進行研究。

目前，脂多糖（LPS）已成為建立炎癥反應的經典試劑，LPS 誘導鼠肺損傷已成為評價抗炎癥反應藥物的常用動物模型［6］。本文擬通過LPS 造模建立急性肺損傷模型，以地塞米松為陽性藥，比較不同劑量的枯芩及子芩醇提物對該模型的藥效，以期確定枯芩的臨床作用，為精準用藥、最大發揮其藥效提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器 搖擺式高速粉碎機（型號DFY?800C，溫嶺市林大機械有限公司）；艾柯實驗室超純水機（型號AKSW?V?08，成都艾柯水處理設備有限公司）；旋轉蒸發器（型號RE?5205，上海亞榮生化儀器廠）；SCIENTZ?12N 冷凍干燥機（型號16?0071，寧波新芝生物科技股份有限公司）；醫用低溫保存箱（-80 ℃）（型號MDF?86V340E，安徽中科都菱商用電器股份有限公司）；酶標儀（型號EPOCH2，上海玉博生物科技有限公司）；奧林巴斯倒置顯微鏡［型號CKX53，成貫儀器（上海）有限公司］。

1.2 試劑與藥物 子芩飲片（產地河南，批號20161217）、枯芩飲片（產地河南，批號20161207）均購自湖北天濟中藥飲片有限公司，經湖北中醫藥大學張秀橋教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。地塞米松片［西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，批號L8880］。脂多糖（LPS）（北京索萊寶科技有限公司，批號813Q0312）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號P0012）；丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號A003?1）；髓過氧化物酶（MPO）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號A044）；白介素1β（IL?1β）酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號E?EL?M 0037c）；白介素6（IL?6）酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號E?EL?M0044c）；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF?α）酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號E?EL?M0049c）；白細胞稀釋液（南京建成生物工程研究所，批號C025?1?1）。

1.3 動物 C57BL／6 小鼠，雄性，SPF 級，體質量（20±2）g，由湖北省三峽大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK（鄂）2017?0067。

2 方法

2.1 藥液制備 分別稱取枯芩、子芩飲片，打粉，用10倍量70%乙醇加熱回流提取2 次，第1 次2 h，第2 次1 h，合并2 次濾液，旋蒸，冷凍干燥，枯芩得率為39.82%；同法制備子芩醇提物，得率為43.48%。取2 種醇提物凍干粉適量至量瓶中，加入蒸餾水，定容，混勻，即得。

2.2 造模、分組及給藥 112 只雄性C57BL／6 小鼠在相對濕度（55±5）%、溫度（23±2）℃的實驗室環境下適應性飼養1 周，按體質量隨機分為正常組、模型組、陽性藥組（地塞米松，10 mg／kg）、枯芩醇提物低劑量組（3.28 g／kg）、枯芩醇提物高劑量組（6.56 g／kg）、子芩醇提物低劑量組（3.58 g／kg）、子芩醇提物高劑量組（7.16 g／kg），每組16只，給藥劑量為0.2 mL／10 g，正常組和模型組用蒸餾水灌胃。給藥7 d 后進行造模，造模前24 h 禁食不禁水。第7天當天灌胃2 h 后實驗組用LPS（10 mg／kg）滴鼻造模6 h，正常組滴鼻給予相同容量0.012 5 mL／10 g 磷酸鹽緩沖液。

2.3 樣品采集與處理 每組小鼠均分為2 批，1 批用于眼球取血及取肺組織，1 批用于肺泡灌洗［7］，眼球取血用于全血白細胞計數。采集小鼠肺組織，用PBS 沖洗干凈，右肺上葉置于4%多聚甲醛固定，用于常規石蠟包埋，制作石蠟切片，HE 染色，顯微鏡下觀察肺組織炎性細胞浸潤程度；右肺中葉稱濕重（wetweight，W），然后在干燥箱中以80 ℃烘48 h，測定干重（dryweight，D），以W／D評估肺組織的水腫程度［8］。左肺上葉用于MPO 活性測定和MDA水平測定，組織勻漿液于4 ℃、3 500 r／min 條件下離心10 min，取上清液，按照BCA、MPO 以及MDA 各試劑盒說明方法［9］測定蛋白濃度及MPO、MDA 水平。小鼠用水合氯醛麻醉后，剪開頸部皮膚，鈍性分離頸部氣管上方的肌肉，找到總氣管，用剪刀剪一個T 形小口，插管結扎，用預冷的0.1 mol／L 磷酸鹽緩沖液（PBS）進行全肺肺泡灌洗3 次，第1 次0.8 mL，第2 次0.5 mL，第3 次0.2 mL，每次抽洗都要勻速進行，灌洗液（BALF）在4 ℃、1 500 r／min條件下離心10 min，取上清液，采用ELISA 試劑盒對BALF 中IL?6、IL?1β、TNF?α 水平進行測定［10］。

2.4 統計學分析 數據用SPSS21.0 軟件進行分析，計量資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠肺組織濕干比重（W／D）如圖1 所示，與正常組相比，LPS 誘導后小鼠肺組織W／D增大（P＜0.05），出現肺水腫；與模型組相比，枯芩、子芩醇提物高劑量組對小鼠急性肺損傷有改善作用，W／D下降（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組小鼠的肺組織濕干比重

3.2 小鼠肺組織病理切片 HE 染色（圖2）顯示，正常組肺組織結構清晰，肺泡壁較薄且無滲液，未見炎癥細胞浸潤；模型組肺組織結構紊亂，肺泡壁增寬增厚，肺間質出現水腫，并伴有大量炎癥細胞浸潤；各給藥組情況都有所改善，枯芩醇提物高劑量組優于子芩醇提物各劑量組；枯芩醇提物高劑量組肺組織結構較清晰，肺泡壁較模型組更薄，接近正常組。

圖2 各組小鼠肺組織病理切片（×200）

3.3 全血白細胞計數 如圖3 所示，與正常組比較，模型組全血白細胞計數增多（P＜0.01），說明出現炎癥；與模型組比較，枯芩醇提物各劑量組、子芩醇提物高劑量組全血白細胞計數減少（P＜0.05，P＜0.01），說明小鼠急性肺損傷有所改善。

圖3 各組小鼠全血白細胞計數

3.4 丙二醛（MDA）水平 如圖4 所示，LPS 誘導后模型組的MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，枯芩、子芩醇提物各劑量組MDA 水平降低（P＜0.01）。

圖4 各組小鼠MDA 水平

3.5 髓過氧化物酶（MPO）水平 如圖5 所示，LPS 誘導后模型組MPO 水平升高（P＜0.01），給藥組除子芩醇提物低劑量組外，MPO 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），對小鼠急性肺損傷均有顯著改善作用。

3.6 肺泡灌洗液（BALF）中IL?1β、IL?6、TNF?α 水平測定 如圖6 所示，LPS 誘導后模型組肺泡灌洗液（BALF）中IL?1β、IL?6、TNF?α 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，枯芩、子芩醇提物各劑量組IL?1β、TNF?α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），兩者高劑量組IL?6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

4 討論

圖5 各組小鼠MPO 水平

據文獻記載，在古代及現代上世紀七十年代前，臨床上習將黃芩分為子芩和枯芩使用，子芩主瀉大腸濕熱，枯芩主清肺胃上焦之熱，藥效確切。課題組前期研究已表明，枯芩在抑制肺炎鏈球菌以及抗炎的藥理作用上效果均明顯優于子芩，與文獻相符。

急性肺損傷［11］（acute lung injury，ALI）是以低氧血癥和呼吸窘迫為臨床表現的危重癥，嚴重時呈急性呼吸窘迫綜合征，死亡率高達35%～55%，是呼吸內科危重病，病勢迅猛。ALI 發病是由于肺內過度、失控的炎性反應所致。基于黃芩對肺部炎癥良好的治療作用，本實驗進一步研究黃芩兩種規格飲片對急性肺損傷的改善作用，以期用新的病癥模型驗證枯芩對肺部病癥作用優于子芩的科學性。

本研究以C57BL／6 雄性小鼠為研究對象，通過LPS 建立急性肺損傷模型，LPS 是革蘭陰性菌的主要致病成分［12］，是引起ALI 并最終導致患者死亡的重要原因之一，LPS 刺激下，炎癥細胞迅速浸潤肺組織，引起中性粒細胞和巨噬細胞浸潤等炎癥細胞聚集［13］。根據LPS 造模后小鼠HE 病理切片所呈現的炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚，W／D升高，肺水腫，MDA、MPO 水平升高，小鼠肺組織發生了過氧化反應，且過氧化降解產物水平升高，IL?6、IL?1β、TNF?α 和全血白細胞計數等指標均增多，小鼠肺組織發生炎癥，炎癥細胞浸潤聚集肺組織。說明LPS 誘導的小鼠急性肺損傷模型的癥狀與臨床上觀察到的病理癥狀相似，可見LPS 滴鼻誘導小鼠急性肺損傷模型有效［14］。

本研究結果表明，陽性藥地塞米松、枯芩和子芩醇提物均對由LPS 誘導的小鼠急性肺損傷有改善作用，使模型組小鼠癥狀減輕，可抑制肺組織過氧化，減少MPO、MDA等的生成和釋放，進而減輕肺組織脂質過氧化損傷。在生理條件下，IL?1β、IL?6、TNF?α 等炎癥因子水平非常低，但在病理條件刺激下會大量分泌及釋放［15］，本實驗表明用藥后可使炎癥因子IL?1β、IL?6、TNF?α 水平降低，并使全血白細胞數量生成減少，W／D降低，使肺水腫及炎性細胞浸潤等情況得到改善。組間比較發現，枯芩組作用優于子芩組，枯芩醇提物高劑量組改善效果最佳，接近正常組，進一步驗證了枯芩相較子芩對肺部炎癥作用更有優勢。綜上所述，本實驗可為黃芩在臨床應用中有必要區分為子芩和枯芩提供實驗依據。

圖6 各組IL?1β、IL?6、TNF?α 水平