荷梗對慢性應激小鼠的抗抑郁作用及其對TPH2 和β CaMKII 表達的影響

張延紅 曹亞飛 趙亞男 平 鑫 張少丹 裴 林

（1.河北中醫學院， 河北 石家莊050031； 2.華北理工大學中醫學院， 河北 唐山063000； 3.河北大學中醫學院， 河北 保定071051； 4.河北省中醫藥科學院， 河北省濁毒證重點實驗室， 河北 石家莊050031）

抑郁癥是一種常見的慢性精神障礙性疾病，嚴重影響人的思維，情緒和身體健康［1］。據世界衛生組織（WTO）預測到2030 年全球將有3.5 億人罹患抑郁癥，且抑郁癥在各個年齡段均可患病，其特點是情緒低落，缺乏活力，睡眠障礙，并在一定程度上伴有生活或工作能力的下降［2］。然而，到目前為止抑郁癥的臨床用藥并沒有得到令人滿意的效果［3］。

荷梗屬于睡蓮科蓮亞科植物睡蓮的葉柄及花柄，又稱藕桿、蓮蓬桿、荷葉梗，味苦，性平，入脾、膀胱經，功效通氣寬胸、和胃安胎，主治外感暑濕、胸悶不暢、妊娠嘔吐、胎動不安［4］。本課題前期臨床和實驗研究表明，含有荷梗的中藥復方具有很好的抗抑郁作用［5］；本研究采用慢性不可預見性溫和刺激復制抑郁癥小鼠模型，探索荷梗的抗抑郁效應及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級健康雄性ICR 小鼠40 只，購自河北醫科大學動物實驗中心，生產許可證號SCXK（冀）2018?004，鼠齡7 周左右，體質量（30±5）g。

1.2 試劑與藥物 荷梗（批號180901）由河北中醫藥科學院附屬醫院提供，經河北省師范大學趙建成教授鑒定為正品，稱定100 g 于10 倍量蒸餾水中浸泡1 h，溫火煎煮2次，每次25～30 min，2 次濾液混勻后濃縮至生藥量2、1 g／mL，再次過濾、分裝，4 ℃保存備用；氟西 汀片（20 mg，法國生產，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批號J20170022）。Anti?TPH2 antibody（英國Abcam 公司，批號ab6336）；Anti?β CaMKII antibody（英國Abcam 公司，批號ab1806）；PV?9001 兔二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號K182430C）；PV?9003 山羊二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號K1824231）。

1.3 儀器 CX41 生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；RM2245 旋轉式切片機（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 小鼠抑郁模型制備 參照前期實驗方法［6］稍作改良。除正常組外共用14 種應激刺激方法，分別為晝夜顛倒24 h、束縛2 h、禁食24 h、噪音2 h、禁水24 h、傾斜24 h、空籠24 h、冰水游泳5 min、異味24 h（每周不同）、搖晃5 min、潮濕24 h、熱水游泳5 min、夾尾1 min、異物24 h（每周不同）。每天隨機選取2 種進行，刺激方式不可預見，持續21 d。

2.2 分組、給藥 適應性飼養1 周后，小鼠根據糖水偏愛分數隨機分為正常組、模型組、氟西汀組及荷梗低、高劑量組，每組8 只。造模結束后，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，陽性對照組給予氟西?。?0 mg／kg）灌胃，荷梗高、低劑量濃度比為2 ∶1，分別為0.4、0.2 g／kg，每天1 次，給藥21 d。

2.3 糖水偏愛實驗 參照前期文獻報道，稍作改良［7］。小鼠在適應性飼養期間進行糖水訓練，第1 天每籠均放2 瓶1%蔗糖水，第2 天一瓶為1%蔗糖水，一瓶為純水，之后禁食禁水24 h，第4 天給予一瓶1% 蔗糖水、一瓶純水，24 h后測糖水消耗，計算糖水偏好，公式為糖水偏好＝（糖水消耗／總液體消耗）×100%，正式實驗于給藥21 d 后檢測。

2.4 強迫游泳實驗 強迫游泳試驗是參照Lin 等［8］的實驗方法設計。在正式測試前1 d，小鼠放入高50 cm、長20 cm 的玻璃器皿（水溫25 ℃左右）中適應性游泳訓練15 min，正式實驗時記錄6 min 內出現靜止不動的潛伏期和靜止不動時間（后4 min），靜止的標準是小鼠僅有頭部露出水面，或只做為保持平衡四肢微微波動的動作。

2.5 曠場實驗 參照前人研究［9］，曠場實驗需在安靜、光線暗的環境中進行。在正式試驗前，所有小鼠均需在曠場（60 cm×60 cm，正方形底面等分成5 cm×5 cm 方格）內適應1 h，正式實驗時從曠場中央區域放入，由動物行為分析系統記錄5 min 內小鼠在中央區累計行走距離、在中央區停留時間和反復進入中央區的次數。

2.6 免疫組織化學檢測 行為學測試結束后，所有小鼠用10%水合氯醛（5 mg／kg）腹腔麻醉，生理鹽水透心灌流至肝臟發白后用4%多聚甲醛灌注，取全腦組織用于免疫組化，石蠟切片透明、脫蠟至水，經微波加熱抗原修復，山羊血清室溫封閉30 min，分別對應腦部位滴加Anti?TPH2抗體（1 ∶300）和Anti?β CaMKII 抗體（1 ∶200），置于4 ℃冰箱中12 h，PBS 洗3 次，5 min／次，分別對應滴加山羊抗兔IgG 和兔抗山羊IgG（二抗稀釋倍數均為1 ∶200），室溫下孵育30 min，PBS 溶液沖洗3 次，5 min／次，DAB顯色反應3～5 min，水洗10 min 終止反應，蘇木精復染，梯度酒精脫水，封片，CX41 顯微照相系統觀察，每只小鼠取5 張腦片，計數各組中縫背核TPH2 和外側韁核CaMKII β 的免疫陽性細胞數。

2.7 統計學分析 應用SPSS 23.0 軟件進行處理，實驗數據以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩兩比較如果方差齊則采用SNK?q 檢驗，如果方差不齊則采用Kruskal?Wallis 非參數檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 糖水偏愛 與正常組相比，模型組糖水偏愛分數減少（P＜0.01）；與模型組相比，氟西汀組及荷梗高劑量組糖水偏愛分數增加（P＜0.01），而且荷梗劑高劑量組與氟西汀組相比無差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠糖水偏愛分數的比較（， n＝8）

表1 各組小鼠糖水偏愛分數的比較（， n＝8）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 強迫游泳 與正常組相比，模型組小鼠強迫游泳不動時間延長，潛伏期縮短（P＜0.01）；與模型組相比，荷梗各劑量組、氟西汀組小鼠迫游泳不動時間縮短，潛伏期延長（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠強迫游泳不動時間和潛伏期的比較（，n＝8）

表2 各組小鼠強迫游泳不動時間和潛伏期的比較（，n＝8）

注：與正常組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 曠場實驗 與正常組相比，模型組小鼠在中央區行走距離、中央區停留時間減短，反復進入中央區次數減少（P＜0.01）；與模型組相比，荷梗各劑量組、氟西汀組小鼠在中央區行走距離、在中央區停留時間增長，反復進入中央區的次數增加（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠中央區行走距離、中央區停留時間、反復進入中央區次數的比較（， n＝8）

表3 各組小鼠中央區行走距離、中央區停留時間、反復進入中央區次數的比較（， n＝8）

注：與正常組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 相應腦區TPH2、β CaMKII 表達 與正常組相比，模型組小鼠中縫背核TPH2 的陽性細胞數量減少，外側韁核β CaMKII 的陽性細胞數量增多（P＜0.01）；與模型組相比，荷梗各劑量組和氟西汀組小鼠中縫背核TPH2 陽性細胞數量增多（P＜0.01），外側韁核βCaMKII 的陽性細胞數量減少（P＜0.05）。見表4、圖1。

4 討論

一般認為，應激是誘發抑郁癥的一個重要因素，慢性不可預見性溫和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）［10］建立小鼠的抑郁模型是一種常見的動物模型，該模型動物的行為表現與人類抑郁癥的表現高度相似。本研究觀察到，模型組小鼠的糖水偏愛分數顯著降低，證實造模成功，且模型組小鼠的強迫游泳不動時間明顯增加，強迫游泳潛伏期顯著縮短，用臨床上公認的西藥氟西汀作為陽性對照藥，來驗證中藥荷梗的抗抑郁作用。曠場實驗可檢測小鼠在新異環境中的探究行為、緊張恐懼狀態和對新環境的警覺性。本研究中，運動能力和探索行為能力的下降是抑郁癥小鼠出現的典型表現。本研究結果顯示，與模型組相比，中藥荷梗組尤其高劑量組小鼠在中央區累計行走距離及在中央區停留時間顯著增長，反復進入中央區的次數顯著增多，且與氟西汀組相當，說明荷?？梢愿纳苿游镆钟魳有袨楹驼J知。

表4 各組小鼠TPH2、β CaMKII 陽性細胞數的比較（， n＝8）

表4 各組小鼠TPH2、β CaMKII 陽性細胞數的比較（， n＝8）

注：與正常組相比，??P ＜0.01；與模型組相比，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖1 各組小鼠TPH2、β CaMKII 表達（免疫組化染色，×200）

研究表明，5?羥色胺（5?HT）系統異常與抑郁癥、焦慮癥、厭食癥、失眠、晝夜節律紊亂、內分泌功能障礙等密切相關［11］。色氨酸羥化酶（TPH）是5?HT 合成途徑中的限速酶，色氨酸羥化酶2（TPH2）是色氨酸羥化酶（TPH）的一個亞型，是5?TH 神經元的特異性標志物之一［12］。據報道，TPH2 在中縫背核（DRN）中特異性表達，其含量減少會直接影響5?TH 的代謝功能，導致情感障礙和自殺行為［13］。韁核是邊緣前腦和邊緣中腦聯系的重要節點，可分為內側韁核（Medial habenula，MHb）和外側韁核（Lateral habenula，LHb）。鈣／鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II亞單位β（β CaMKII）是一種鈣依賴性蛋白激酶，在部位表達上具有韁核特異性。LHb 和DRN 在調節抑郁中發揮重要作用。這兩個區域在結構和功能上有著密切的聯系。LHb 在應激條件下過度活躍，向下游的投射信號增強，可直接投射到DRN，抑制5?HT 的釋放，從而導致抑郁的發生［14］。而LHb 在應激條件下被過度活化，可能是由于突觸前膜谷氨酸釋放增加，上調β CaMKII，提高興奮性突觸在AMPA 型受體的傳播，而且LHb 可以直接控制DRN，并直接影響多巴胺能和5?HT 能的大腦系統，這些系統涉及多種大腦功能和神經精神疾病，比如抑郁癥。目前認為韁核是調節厭惡行為和逃避行為的關鍵腦區，中縫背核是調節獎賞行為的關鍵腦區。外側韁核和中縫背核之間有往返纖維，這表明對于某種刺激，小鼠選擇厭惡性逃避還是進一步探索，可能是上述腦區協同調節的結果。如果外側韁核神經元有更多活化，對中縫背核的抑制可能增加，表現為探索行為減少。反之，獎賞環路活化，探索行為增加。實驗結果表明，與正常組相比，模型組小鼠腦內β CaMKII 的表達明顯增多，TPH2 的表達顯著減少，此結果與之前報道吻合［15］。與模型組相比，中藥荷梗各劑量組小鼠腦內β CaMKII的表達明顯減少，TPH2 的表達顯著增多，且荷梗高劑量組的表達水平與西藥氟西汀組相當。由此推斷荷梗的抗抑郁作用機制可能與調節外側韁核中β CaMKII 及中縫核中TPH2 水平的表達有關。

綜上所述，荷梗對CUMS 小鼠具有抗抑郁作用，而通過抑制β CaMKII 的過度活化，從而減少對TPH2 的抑制可能是其作用機制之一。