鱉甲?莪術藥對含藥血清對MCF?7 人乳腺癌細胞的影響

胡雅清 陳騰祥 張金娟 謝 青 張晨宇 朱曼荊 謝 甦?

（1.貴州醫科大學， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫科大學附屬醫院， 貴州 貴陽550004）

如今癌癥已成為威脅人類生存和社會發展的主要疾病之一，在不同地域不同人群中，乳腺癌也都是備受關注的主要癌癥。在全球著名學術刊物《CA：A Cancer Journal for Clinicians》 發布的美國2018 年癌癥統計報告中顯示，女性新發癌癥病例的30%都是乳腺癌，遠遠超過其他癌癥，同時我國國家癌癥中心發布的癌癥負擔最新結果表明，乳腺癌也位居女性癌癥發病率首位［1］。鱉甲?莪術藥對是國醫大師劉尚義治療惡性腫瘤的常用組合，使用頻次最多，達1 201 次，已有十余年臨床應用實踐，但尚缺乏分子水平藥理學研究［2?4］。鱉甲味咸、性微寒，歸肝腎經，能滋陰潛陽、退熱除蒸、善于軟堅散結［5］；莪術味辛、苦，性溫，歸肝、脾經，有行氣破血、消積止痛之功效［6］；鱉甲味咸而補益屬陰，莪術味辛而走散屬陽；鱉甲滋陰散結，莪術行氣破血，兩藥合用，一補一攻、寒溫相宜、陰陽相適、為消積聚癥瘕之要藥［7］。本實驗基于Wnt／β?catenin 信號通路，探討鱉甲?莪術藥對含藥血清對乳腺癌細胞增殖的抑制作用。

1 材料

1.1 細胞株 MCF?7 人乳腺癌細胞株，由中國科學院上海細胞庫提供。

1.2 動物 SPF 級雌性SD 大鼠55 只，體質量220～260 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，生產許可證號SCXK（湘）2014?0011，動物質量合格證號43006700016478。

1.3 藥物 醋鱉甲顆粒劑（批號8127093）、莪術顆粒劑（批號8071933）均購自廣東一方制藥有限公司。

1.4 試劑 DMEM 培養基（美國Gibco 公司，貨號8119234）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，貨號19080505）；BD Pharmingen 流式周期試劑盒（美國Sigma 公司，貨號9039585）；噻唑藍（MTT，北京索萊寶科技有限公司，貨號725c056）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，貨號2046777）；青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司，貨號J190003）；5?氟尿嘧啶MB1273（大連美侖生物有限公司，貨號s0808a）；Anti?Cyclin D1 抗 體（英 國 Abcam 公 司，貨 號GR3212345?11，稀釋倍數1／10 000）；Anti?c?Myc抗體（英國Abcam 公司，貨號GR3232703?2，稀釋倍數1／1 000）；Anti?beta Catenin 抗體（英國Abcam公司，貨號GR184212?61，稀釋倍數1／5 000）。

1.5 儀器 SW?CJ?2FD 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；Model 310 恒溫CO2培養箱（美國Thermo 公司）；CKX41 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；16K 臺式自動離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；Allegra 64R Centrifuge 臺式高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter 公司）；多功能酶標儀（美國BioTek 公 司）；EPICL XL 型流式細胞儀（美 國Beckman Coulter 公司）；ChemiDoc MP 凝膠成像系統（美國Bio?Rad 公司）；MiniVE 電泳儀（美國GE 公司）；全自動雪花制冰機IMS?40（常熟市雪科電器有限公司）；MDF?382E 超低溫冰箱（日本SANYO 公司）；KS130B 脫色搖床（德國IKA 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養 培養人乳腺癌細胞株MCF?7 于含10%胎牛血清的DEME 培養基中，再將其置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度細胞培養箱中培養，次日換液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。當細胞生長到70%～80% 時，可進行消化傳代或用于實驗。

2.2 藥物血清制備 將大鼠隨機分鱉甲組、莪術組、鱉甲?莪術藥對組各10 只，空白組25 只，以給藥劑量為其等效劑量的20 倍計算，確定鱉甲給藥劑量為3 g／kg，莪術給藥劑量為1.5 g／kg，鱉甲?莪術藥對給藥劑量為4.5 g／kg，每天2 次，連續7 d。最后1 次給藥前大鼠禁食不禁水12 h，給藥后2 h 水合氯醛麻醉，心尖取血，2 000 r／min 離心15 min 取血清，同組混合以消除個體差異，56 ℃下滅活30 min，0.22 μm 過濾除菌，-80 ℃下保存備用。

2.3 細胞分組 正常MCF?7 細胞分為空白血清組（10%空白血清＋90%DMEM 培養基培養）、鱉甲低劑量組（2.5% 鱉甲血清＋7.5% 空白血清＋90%DMEM 培養基培養）、鱉甲中劑量組（5% 鱉甲血清＋5%空白血清＋90%DMEM 培養基培養）、鱉甲高劑量組（10% 鱉甲血清＋90% DMEM 培養基培養）、莪術低劑量組（2.5% 莪術血清＋7.5% 空白血清＋90% DMEM 培養基培養）、莪術中劑量組（5%莪術血清＋5%空白血清＋90%DMEM 培養基培養）、莪術高劑量組（10%莪術血清＋90%DMEM 培養基培養）、鱉甲?莪術藥對低劑量組（2.5%鱉甲?莪術藥對血清＋7.5%空白血清＋90%DMEM 培養基培養）、鱉甲?莪術藥對中劑量組（5%鱉甲?莪術藥對血清＋5% 空白血清＋90% DMEM 培養基培養）、鱉甲?莪術藥對高劑量組（10%鱉甲?莪術藥對血清＋90%DMEM 培養基培養）、陽性對照組（10% 空白血清＋90% DMEM 培養基培養＋10 mg／mL 氟尿嘧啶）。

2.4 MTT 法檢測細胞增殖 取對數生長期的MCF?7 細胞，取100 μL 濃度為1 × 105／ mL 者接種于96 孔培養板中，每組5 個復孔，1 d 后加入饑餓培養液饑餓24 h 使細胞同步化，換不同劑量10%空白血清培養基、鱉甲血清培養基、莪術血清培養基、鱉甲?莪術藥對血清培養基和含10 mg／mL 陽性藥的空白血清培養基，在培養箱中分別培養48、72 h。培養結束后，于相應時間點在96 孔板中加入MTT 溶液20 μL，在培養箱中繼續培養4 h 后，吸棄孔內培養上清液，每孔加入二甲基亞砜（DM?SO）150 μL，37 ℃下振蕩10 min，使結晶充分溶解，于490 nm 波長處測定光密度（OD），計算細胞增殖抑制率，公式為抑制率＝（1-OD實驗組／OD對照組）× 100%，重復3 次。

2.5 流式細胞術檢測MCF?7 細胞周期 取對數生長期的MCF?7 細胞，取1 mL 濃度為1 × 105／mL 者接種于6 孔培養板中，1 d 后加入饑餓培養液饑餓24 h 使細胞同步化，換不同劑量10% 的空白血清培養基、鱉甲血清培養基、莪術血清培養基、鱉甲?莪術藥對血清培養基和含10 mg／mL 陽性藥的空白血清培養基作用48 h，根據細胞周期檢測試劑盒說明書進行操作。

2.6 Western blot 檢測β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達 取對數生長期的MCF?7 細胞，取1 mL濃度為1×105／mL 者胞接種于6 孔培養板中，1 d 后加入饑餓培養液饑餓24 h 使細胞同步化，換不同劑量10%空白血清培養基、鱉甲血清培養基、莪術血清培養基、藥對血清培養基和含10 mg／mL陽性藥的空白血清培養基作用48 h，棄上清，PBS沖洗3 次，加入適量細胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、15 000 r／min 離心20 min，取上清，BCA 法對所提總蛋白進行定量，規定上樣量為30 μg，加入Loading Buffer 煮沸變性，10% SDS?PAGE 凝膠電泳分離，電轉移至PVDF 膜，一抗4 ℃下孵育過夜，二抗室溫下孵育2 h，ECL 化學發光液孵育。凝膠成像系統掃描，并定量分析條帶光密度值。

2.7 統計學分析 運用SPSS 20.0 統計軟件進行處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組含藥血清對MCF?7 細胞增殖的影響 與空白血清組比較，各含藥血清組作用48、72 h 后均能抑制MCF?7 細胞增殖（P＜0.05，P＜0.01）。同一中藥不同劑量的抑制率依次為高劑量組＞中劑量組＞低劑量組，而同一劑量不同中藥抑制率依次為藥對鱉甲?莪術含藥血清組＞莪術含藥血清組＞鱉甲含藥血清組。見表1。

表1 含藥血清對MCF?7 細胞增殖的影響（， n＝3）Tab.1 Effect of medicated serum on the proliferation of MCF?7 cells（， n＝3）

表1 含藥血清對MCF?7 細胞增殖的影響（， n＝3）Tab.1 Effect of medicated serum on the proliferation of MCF?7 cells（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.2 含藥血清對MCF?7 細胞周期的影響 與空白血清組比較，各含藥血清組作用48 h 后G0 ／G1 期細胞比例增加（P＜0.05，P＜0.01），S 期細胞比例減?。≒＜0.05，P＜0.01），表明各組含藥血清作用MCF?7 細胞后均可阻止G1／G0 期的細胞順利進入S期及G2 期，從而使MCF?7 細胞的有絲分裂過程受到干擾，導致其增殖受到抑制，且趨勢與MTT 一致。見圖1、表2。

圖1 含藥血清對MCF?7 細胞周期的影響Fig.1 Effect of medicated serum on the cell cycle of MCF?7 cells

3.3 含藥血清對β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達的影響 與空白血清組比較，各含藥血清組作用48 h 后β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 表達均降低（P＜0.05，P＜0.01），表明含藥血清可抑制Wnt／β?catenin 信號通路中β?catenin 的表達，下調靶基因cyclinD1，c?Myc 的表達，從而抑制MCF?7細胞增殖。見表3～6、圖2。

表2 含藥血清對MCF?7 細胞周期的影響（， n＝3）Tab.2 Effect of medicated serum on the cell cycle of MCF?7 cells（， n＝3）

表2 含藥血清對MCF?7 細胞周期的影響（， n＝3）Tab.2 Effect of medicated serum on the cell cycle of MCF?7 cells（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表3 鱉甲含藥血清對β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of serum medicated with Trionycis Carapax on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

表3 鱉甲含藥血清對β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of serum medicated with Trionycis Carapax on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表4 莪術含藥血清對β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.4 Effects of serum medicated with Zedoary Turmeric on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

表4 莪術含藥血清對β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.4 Effects of serum medicated with Zedoary Turmeric on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

4 討論

西醫認為，乳腺癌發病涉及多個因素的影響，該病的發生與生育史、性腺激素刺激、家族遺傳史等因素有關；中醫認為，正氣不足是乳腺癌發病的根本原因，情志因素是乳腺癌發病的重要誘因，正氣不足、情志內傷會引發臟腑功能嚴重異常，由于肝臟、腎臟、脾功能失調使氣血運行紊亂，長期如此，痰瘀交阻于乳絡，從而導致乳癌的發生［8?9］，癌毒耗損機體正氣，日久則導致氣陰兩虛、痰瘀交阻。針對這一病理機制，劉老提出“陰陽雙消、滋陰起亟” 的治療理念，并在此基礎上以鱉甲?莪術藥對為君藥臨床治療乳腺癌上萬例，療效顯著，可使患者獲得較好的生存質量及較長的生存周期。

表5 鱉甲?莪術藥對含藥血清對β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.5 Effects of serum medicated with Trionycis?Carapax Zedoary Turmeric on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

表5 鱉甲?莪術藥對含藥血清對β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.5 Effects of serum medicated with Trionycis?Carapax Zedoary Turmeric on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表6 各組高劑量含藥血清對β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.6 Effects of each group treated with high?dose medicated serum on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

表6 各組高劑量含藥血清對β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.6 Effects of each group treated with high?dose medicated serum on the protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1（， n＝3）

注：與空白血清組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

目前，血清藥理學是研究中藥復方抗腫瘤作用的有效方法，也是從細胞分子水平研究中藥藥理學的新手段［10］，故本實驗以其為理論指導探討鱉甲?莪術藥對含藥血清治療乳腺癌的機制。

圖2 Western blot 檢測β?Catenin、c?Myc、cyclin D1 蛋白表達Fig.2 Protein expressions of β?Catenin，c?Myc and cyclin D1 by Western blot

乳腺癌的發生及發展與Wnt 信號通路功能失調有密切的關系，cyclin D1、c?Myc 是Wnt 信號轉導通路中至關重要的靶基因［11?12］，研究表明抑癌基因失活和癌基因的激活可異常激活Wnt／β?catenin 信號通路，β?catenin 降解障礙可導致c?Myc等靶基因激活及細胞周期調控出現異常，從而導致乳腺癌的發生［13］。cyclin D1 作為調控細胞周期G1期的關鍵蛋白之一，其過度表達可以促進細胞由G1 期進入S 期，促進細胞周期轉換速度的加快，最終引起細胞增殖失控，導致癌變［14］。c?Myc 基因既可刺激細胞增殖又可誘導細胞凋亡，其作用是通過調節細胞由G1 期進入S 期完成的，高水平的c?Myc mRNA 可加快細胞進入S 期的速度，導致腫瘤的發生［15］。

綜上所述，各組含藥血清均可抑制MCF?7 細胞增殖，促進其凋亡，其抗乳腺癌的機制可能與下調β?catenin 及β?catenin 下游靶基因cyclin D1、c?Myc 蛋白表達，阻止G1／G0 期的細胞順利進入S期及G2 期，導致其增殖受到抑制有關。此外，鱉甲?莪術藥對的抑制作用高于單味藥，可能是配伍后相得益彰，間接輔助某一功能發揮，從而發揮協同增效的作用［16］。由于乳腺癌形成的機制十分復雜，涉及多種細胞、細胞因子以及多條信號通路，因此鱉甲?莪術藥對含藥血清抗乳腺癌作用及其機制仍需進行大量體內外實驗作進一步探討。