人字果質量標準的研究

趙 超 徐文芬 孫慶文 柏彩紅

（貴州中醫藥大學， 貴州 貴陽550025）

人字果又名巖節連，為毛茛科人字果屬植物蕨葉人字果Dichocarpum dalzielii（Drumm.et Hutch.）W.T.Wang et Hsiao 的干燥全草或根莖，為貴州民間常用藥材，具有清熱解毒、消腫止痛的功效［1］，主要分布于貴州、四川、江西、廣西等地［2?5］。2015 年，貴州食品藥品監督管理局修訂2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》，將人字果列為新增補藥材品種。

目前，關于人字果的研究較少，僅涉及分類學方面［6?13］。課題組前期采用LC?MS、對照品及文獻比對［14?16］等方法，明確了人字果中含有木蘭花堿，它具有抗炎、抗抑郁、抗菌等活性，而且對骨關節軟骨變形有一定抑制作用［17?20］，這與該藥材消腫止痛功效密切相關，但質量控制手段的缺乏嚴重制約了其良性發展。因此，本實驗通過HPLC?DAD、酸性染料比色法分別首次測定人字果中木蘭花堿、總生物堿含有量，并按照2015 年版《中國藥典》四部通則方法測定水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含有量，以期為有效控制該藥材質量提供依據，也為其后續開發利用奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate?3000 型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測器（美國Thermo 公司）；UV1800 型紫外?可見分光光度計（日本島津公司）；AG135 型電子天平（瑞士Mettler?Toledo 公司）；KQ?500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Pntulips BP?C18色譜柱（上海譜寧分析技術有限公司）。

1.2 試劑與藥物 木蘭花堿對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST?17071711，純度99.02%）。乙腈為色譜純（美國天地公司）；磷酸、三乙胺、二水合磷酸二氫鈉、溴百里香酚藍、二氯甲烷、甲醇、乙醇均為分析純；水為重蒸餾水。

1.3 藥材 人字果均為課題組從貴州主要分布地區采集的野生品，經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為毛茛科植物蕨葉人字果Dichocarpum.dalzielii（Drumm.et Hutch.）W.T.Wang et Hsiao 的干燥全草，具體信息見表1。藥材在40 ℃下烘干，粉碎后過3 號篩，置于干燥器中備用。

2 方法與結果

2.1 常規物質檢查與浸出物含有量測定 分別按照2015 年版《中國藥典》 四部通則0832 水分測定法第二法、2302 灰分測定法、2201 浸出物測定法（熱浸法）測定水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含有量，結果見表2。

2.2 木蘭花堿含有量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的木蘭花堿對照品25.02 mg，置于25 mL 量瓶中，75%甲醇定容至刻度，搖勻，即得（1 000.8 mg／L）。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

表2 浸出物、水分、總灰分、酸不溶性灰分含有量測定結果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of extract，water，total ash and acid?insoluble ash（n＝3）

2.2.2 供試品溶液制備 取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入75% 甲 醇25 mL，稱定質 量，超 聲（100 W、40 Hz）提取1 h，取出，放冷，75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取15 mL 續濾液，25 mL 石油醚（30～60 ℃）萃取3～4 次至石油醚層無明顯變化，下層萃取液經0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 色譜條 件 Pntulips BP?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?（0.1%磷酸?0.1%三乙胺）（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～20%A；10～30 min，20%～40% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長270 nm；進樣量10 μL。

2.2.4 專屬性考察 精密吸取對照品、供試品溶液、空白溶液各10 μL，在“2.2.3” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，供試品溶液中各成分色譜峰的保留時間與對照品一致，分離度均大于1.5，而且達到基線分離，峰純度在98%以上，表明該方法專屬性良好。

圖1 木蘭花堿HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of magnoflorine

2.2.5 線性關系考察 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液 0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于5 mL 量瓶中，75%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，在“2.2.3” 項色譜條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝21.796X-0.644 1（r＝0.999 9），在0.200 2～10.01 μg 范圍內線性關系良好。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液10 μL，在“2.2.3” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得木蘭花堿峰面積RSD 為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取藥材粉末（5S）約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24、48 h 在“2.2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得木蘭花堿含有量RSD為0.60%，表明溶液在48 h 內穩定性良好。

2.2.8 重復性試驗 取藥材粉末（5S）6 份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得木蘭花堿含有量RSD 為1.1%，表明該方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 稱取木蘭花堿含有量已知的藥材粉末（5S）9 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別按1 ∶0.5、1 ∶1、1 ∶1.5 比例加入對照品溶液，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表3。

表3 木蘭花堿加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for magnoflorine（n＝9）

2.2.10 樣品含有量測定 取12 批藥材粉末，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表4。

表4 木蘭花堿含有量測定結果（n＝3）Tab.4 Results of content determination of magnoflorine（n＝3）

2.3 總生物堿含有量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的木蘭花堿對照品5.06 mg，置于50 mL 量瓶中，加水稀釋定容至刻度，搖勻，即得（101.2 mg／L）。

2.3.2 供試品溶液制備 取“2.2.2” 項下層萃取液8 mL，稀釋定容至50 mL量瓶中，即得。

2.3.3 緩沖液制備 取0.2 mol／L 磷酸二氫鈉溶液適量，配制成pH 為4.5 的溶液，即得。

2.3.4 顯色劑制備 取溴百里香酚藍0.15 g，2.5 mL NaOH 溶液（1 mol／L）溶解，加水稀釋定容至500 mL，即得。

2.3.5 檢測波長篩選 精密吸取對照品溶液2 mL、供試品溶液（6S）1 mL，置于分液漏斗中，加入12 mL 緩沖液，搖勻，再加入2 mL 顯色劑，搖勻，再加入15 mL 二氯甲烷，充分振搖2 min，靜置1 h 后分取二氯甲烷液；另取12 mL 緩沖液，同法制備空白溶液。按照2015 年版《中國藥典》要求，在300～600 nm 波長處進行掃描，發現對照品、供試品溶液中生物堿與染料所形成的絡合物在409 nm 處均有穩定的最大吸收，故選擇其作為檢測波長。

2.3.6 線性關系考察 精密吸取“2.3.1” 項下對照品溶液0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mL，加水稀釋定容至3 mL，按“2.3.5” 項下方法測定吸光度，在“2.2.3” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝36.094X-0.056 3（r＝0.999 8），在4.048～20.24 mg／L 范圍內線性關系良好。

2.3.7 精密度試驗 取“2.3.1” 項下對照品溶液2 mL，按“2.3.5” 項下方法測定吸光度6 次，測得其RSD 為0.65%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩定性試驗 取藥材粉末（5S）約1.0 g，精密稱定，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，精密量 取1 mL，于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 h 按“2.3.5” 項下方法測定吸光度，測得總生物堿含有量RSD 值為2.2%，表明溶液在5.0 h 內穩定性良好。

2.3.9 重復性試驗 取藥材粉末（5S）6 份，每份約1.0 g，精密稱定，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1 mL，按“2.3.5” 項下方法測定吸光度，測得總生物堿含有量RSD 為1.1%，表明該方法重復性較好。

2.3.10 加樣回收率試驗 取總生物堿含有量已知的藥材粉末（5S）9 份，每份約0.5 g，精密稱定，按1 ∶0.5、1 ∶1、1 ∶1.5 比例加入對照品溶液，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，精密量取1 mL，按“2.3.5” 項下方法測定吸光度，計算回收率，結果見表5。

2.3.11 樣品含有量測定 取12 批藥材粉末，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，精密量取1 mL，按“2.3.5” 項下方法測定吸光度，計算含有量，結果見表6。

3 討論

3.1 木蘭花堿含有量測定中色譜條件、提取方法篩選 本實驗比較了甲醇?水、甲醇?酸水、乙腈?酸水、乙腈?（0.1%磷酸?0.1%三乙胺）的洗脫分離情況，最終選擇乙腈?（0.1%磷酸?0.1%三乙胺）；比較了Thermo Accucore C18（150 mm×4.6 mm，2.6 μm）、依利特Hypersil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent StableBond Analytical（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Pntulips BP?C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱的分離情況，發現以Pntulips BP?C18色譜柱檢測時木蘭花堿色譜峰峰形、分離度良好；再比較了不同柱溫、進樣量對色譜峰峰形、分離度的影響。最終，確定為“2.2.3” 項下色譜條件。

表5 總生物堿加樣回收率實驗結果（n＝9）Tab.5 Results of recovery tests for total alkaloids（n＝9）

表6 總生物堿含有量測定結果（n＝3）Tab.6 Results of content determination of total alkaloids（n＝3）

然后，比較了30%、50%、75%、90%甲醇作為提取溶劑時木蘭花堿的提取率，最終選擇75%甲醇；比較了超聲、回流提取時的提取率，發現兩者無明顯差異，最終選擇操作簡便的前者；再比較了提取時間、料液比對木蘭花堿提取率的影響。最終，確定為“2.2.2” 項下提取方法。

3.2 總生物堿含有量測定中提取方法、顯色條件篩選 本實驗比較了75%鹽酸甲醇、75%甲醇作為提取溶劑時總生物堿的提取率，發現兩者無明顯差異，最終選擇制備方便的后者；比較了不同pH 值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）及用量（8、10、12、14、16 mL）緩沖液下絡合物的吸光度，發現pH 值4.5、用量12 mL 時最大?？偵飰A能否反應與酸性染料用量的關系密切，故本實驗又比較了不同用量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）酸性染料下絡合物的吸光度，發現用量2 mL 時最大。

最后，比較了二氯甲烷、三氯甲烷作為萃取溶劑時對總生物堿的萃取效果，發現兩者無明顯差異，最終選擇毒性較小的前者。同時，比較了不同用量（8、10、12、15、20、25 mL）二氯甲烷下絡合物的吸光度，發現用量15 mL 時最大，并且用量越低，越難以達到分配平衡，結果越不穩定，只有當其達到一定數值后繼續升高，才易于達到分配平衡，萃取結果也更穩定。前期發現，萃取1、2 次時的效果無明顯差異，故選擇1 次。另外，在萃取過程中需不斷振蕩分液漏斗以保證水層與二氯甲烷層充分接觸，從而達到充分萃取的目的，并且振蕩后要給予足夠時間使其分層，才可達到分配平衡。

4 結論

本實驗首次建立了人字果中木蘭花堿、總生物堿含有量的測定方法，其重復性好，穩定可靠，同時測定其中水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含有量，可為該藥材質量標準的制定及資源的開發利用提供依據。