HPLC 法同時測定退赤膠囊中8 種成分

朱應成 余 靜 劉亮鏡 徐 斌

（蕪湖市中醫醫院制劑中心， 安徽 蕪湖241000）

退赤膠囊具有清熱、明目、退翳之功效，臨床上主要用于治療目赤腫痛、畏光、流淚之結膜炎、角膜炎、角膜云翳等外障眼疾［1］，為本課題組聯合蕪湖市中醫醫院眼科專家根據多年臨床經驗總結創制而成，是由金銀花、菊花、連翹、黃芩、桔梗、木賊、密蒙花、谷精草、蒺藜、車前子、甘草11 味藥材經現代制藥技術加工而成的純中藥制劑（皖藥制字Z20050017）。方中君藥金銀花、菊花及臣藥連翹均具有清熱解毒、疏散風熱的功效，主治風熱上攻之目赤腫痛［2?3］；臣藥黃芩含有黃芩苷，具有抗菌、抗病毒的藥理作用［4?5］。

退赤膠囊組方藥味較多，化學成分較復雜，但該制劑現行質量標準僅對連翹酯苷A 進行定量分析，無法全面反映其內在質量，難以實現有效監控。因此，本實驗采用HPLC 法同時測定退赤膠囊中綠原酸［6?8］、咖啡酸［6?7］、阿魏酸［8］、蘆丁［6?8］、連翹酯苷A［9］、連翹苷［9］、黃芩苷［4］、甘草苷［10］的含有量，以期保障該制劑質量的均一性和臨床療效的穩定性。

1 材料

Waters e2695 型高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器（PDA）（美國Waters 公司）；XP?205型電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；KQ?500B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

退赤膠囊（自 制，批 號 181101、181102、181103、181104、181201、181202）。綠原酸（批號110753?201314，純度96.6%）、咖啡酸（批號110885?200102，純度100%，置于五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h 后使用）、阿魏酸（批號110773?201313，純度99.6%，置于五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h 后使用）、甘草苷（批號111610?201106，純 度 93.7%）、蘆 丁（批 號100080?201409，純度91.9%）、連翹酯苷A（批號111810?201707，純 度97.2%）、黃芩苷（批 號110715?201318，純 度93.3%）、連翹苷（批 號110821?201112，純度96.8%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（含0.1%磷酸）（A）?水（含0.1%磷酸）（B），梯度洗脫（0～22 min，9%A；22～23 min，9%～14%A；23～55 min，14%A；55～85 min，14%～28%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫20 ℃；檢測波長277 nm（甘草苷、黃芩苷、連翹苷）、330 nm（綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、連翹酯苷A）；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取咖啡酸、甘草苷、綠原酸、連翹酯苷A、阿魏酸、蘆丁、黃芩苷、連翹苷對照品適量，甲醇稀釋，搖勻，濾過，即得（各成分質量濃度分別為7.71、18.45、31.03、17.19、5.50、8.18、93.94、9.38 μg／mL），在4 ℃下避光保存。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊內容物適量，取約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得，在4 ℃下避光保存。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例，制備缺菊花、金銀花、甘 草、連翹、黃芩的陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 系統適應性考察與專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下各進樣10 μL 測定，結果見圖1。由此可知，各成分色譜峰峰形良好，陰性無干擾。

2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1、3、5、10、15、20 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得各成分峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各成分峰面積RSD 均小于2.0%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批膠囊（批號181101）2 g，共6 份，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各成分含有量RSD 均小于2.0%，表明該方法重復性好。

2.8 加樣回收率試驗 取各成分含有量已知的膠囊（批號181101）內容物約1 g，共6 份，精密稱定，置于50 mL 錐形瓶中，加入對照品溶液適量，再精密加入50 mL 70%甲醇，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、甘草苷、蘆丁、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷平均加 樣回收 率（RSD）分別為 101.8%（0.7%）、102.6%（1.8%）、103.9%（1.5%）、96.9%（2.2%）、101.8%（0.9%）、99.9%（2.4%）、101.3%（2.5%）、102.8%（2.2%）。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.9 樣品含有量測定 取6 批膠囊，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，外標法計算含有量，結果見表2。

表2 各成分含有量測定結果（μg／g）Tab.2 Results of content determination of various constituents（μg／g）

3 討論

3.1 檢測波長篩選 本實驗采用PDA 檢測器，在210～400 nm 波長處進行掃描，發現甘草苷、黃芩苷、連翹苷在277 nm 處有較強吸收，而綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、連翹酯苷A 在330 nm 處有較強吸收。因此，確定檢測波長為277、330 nm。

3.2 流動相篩選 本實驗考察了乙腈?磷酸［11］、甲醇?磷酸［12?13］、甲醇?冰醋酸［14］、甲醇?甲酸［9］等流動相，發現以乙腈?水（含0.1% 磷酸）洗脫時各成分均實現良好分離，與相鄰峰無干擾。另外，在乙腈中加入0.1%磷酸后各成分色譜峰峰形更對稱，系統穩定性更好，可應用于分析時間較長的多成分含有量測定［15］。

3.3 供試品溶液制備方法篩選 本實驗比較了不同提取溶劑（70% 甲醇、90% 甲醇）、提取方法（超聲、加熱回流）、提取時間（30 min、1 h）的效果，發現2 種提取方法下各成分含有量相差不大，從操作簡便的角度考慮，選擇超聲提取；70%甲醇提取時，各成分提取率最高；2 種超聲時間對提取影響不大。最終確定，供試品溶液制備方法為70%甲醇超聲提取30 min。

4 結論

本實驗采用HPLC 法同時測定退赤膠囊中綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、甘草苷、蘆丁、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷的含有量，該方法簡便可靠，重復性好，可用于該制劑質量控制。