人參皂苷Rg3聯合紫杉醇抑制人肝癌細胞HepG2增殖和對裸鼠移植瘤模型的作用機制研究

張奉海，張瑞榮，陳淑娟，王金紅，于永蘭

(山東省日照市莒縣中醫醫院,山東 日照 276500)

紫杉醇(paclitaxel，Taxol)是從中藥紅豆杉中提取的抗腫瘤活性成分，在抗腫瘤方面具有顯著的療效[1]，可有效抑制癌細胞的增殖擴散，在多種癌癥的治療上取得了一定的療效，但是其潛在的不良反應及耐藥性使得紫杉醇的使用受到了一定的限制[2]。人參皂苷Rg3(Ginsenoside-Rg3，GS-Rg3)，是從中藥人參中提取的單體，國內外許多實驗和臨床研究發現具有抗腫瘤的作用，目前人參皂苷Rg3對胃癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、大腸癌等腫瘤方面的實驗研究較多，但是對于人參皂苷Rg3聯合紫杉醇治療肝癌方面的研究較少[3-5]。

本實驗旨在通過人參皂苷Rg3聯合紫杉醇抗肝癌的體內外研究，初步探討兩藥聯合是否具有協同抑制肝癌細胞的作用，為臨床應用人參皂苷Rg3聯合紫杉醇治療肝癌提供基礎理論及實驗依據。

1 材料

1.1 主要試劑

人參皂苷Rg3(瑞錦生物技術有限公司，純度>99%，批號JZ15110202)；紫杉醇(山東博科生物，純度>98%，批號A0820a)；DMEM (山東博科生物，批號20170521)；MTT(山東博科生物，批號20180607)。

1.2 主要儀器

CO2培養箱(Thermo，型號LHH.CP-250-Q)；倒置顯微鏡(上海精密儀器儀表公司，型號XDS-1A)；H2050R臺式低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；多功能酶標儀(美國Thermo公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；暗盒(上海百研生物科技有限公司)。

1.3 動物及細胞株

人肝癌HepG2細胞株(中國科學院生命科學研究所)；無特定病原體(SPF)級BALB/cA-nu裸鼠40只，體質量(100±20)g，購于山東醫科大學動物實驗中心。

2 方法

2.1 細胞的培養

肝癌細胞培養于含10%的胎牛血清的DMEM培養基或1640培養基，并加入1%青霉素和鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態，1～2 d更換培養基1次，每2～3 d加入胰酶進行消化，傳代。

2.2 人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤

取“2.1”項培養的對數生長期的細胞，在低速離心機(1 000 r/min，5 min)上離心，制成濃度為1×106/mL的混懸液。蘸取碘伏消毒裸鼠右腋下部位，使用1 mL一次性無菌注射器抽取0.2 mL混懸液注入此處皮下，5～7 d內即可觸及皮下有結節，2周左右可見腫瘤形成，選擇瘤體直徑為(65±5)mm的裸鼠移植瘤模型納入下一步實驗。

2.3 分組及給藥

將造模成功的40只裸鼠隨機分為4組：對照組,生理鹽水0.2 mL，灌胃；人參皂苷Rg3組,GS-Rg3:10 mg/(kg·d)，灌胃；紫杉醇組,Taxol：10 mg/kg，腹腔注射，每周2次；聯合組，GS-Rg3+Taxol，給藥劑量和方法同上。每組10只，給藥3周后，頸椎脫臼處死，分離瘤體組織。

2.4 抑瘤率

取“2.3”項分離的瘤體組織，計算各實驗組的腫瘤體積(V)、相對腫瘤體積(RTV)及相對腫瘤抑制率(T/C)。具體計算方式[6]如下：

腫瘤體積(V)=(a×b2)/2

相對腫瘤體積(RTV)=Vt/ V0

相對腫瘤抑制率(T/C)=(1-TRTV/ CRTV)×100%

其中a為腫瘤的最長直徑，b為垂直于a的最短直徑；V0為首次給藥前的腫瘤體積；Vt為每次測量的體積；TRTV為給藥組的相對腫瘤體積；CRTV為對照組的相對腫瘤體積。

2.5 MTT檢測細胞的增殖

將肝癌細胞隨機分為對照組(正常培養)、人參皂苷組(10、20、40、80、100 μg/mL)、紫杉醇組(80 μg/mL)、聯合組給藥劑量同上；調整各組細胞至合適濃度，接種于96孔板上，置于培養箱中培養0、24、48、96 h后，每孔細胞加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h，每孔加入200 μL DMSO，置于酶標儀中檢測細胞在570 nm的吸光值。

2.6 Western blot實驗檢測細胞凋亡

加入裂解液，提取總蛋白，測定其濃度，并與適量上樣緩沖液混合均勻，沸水加熱10 min，變性；將配置好的聚丙烯酰胺凝膠放入電泳槽，加入電泳液，微量移液器吸取40 μg總蛋白加入上樣孔中，電泳至藍色條帶分離后調整電壓，待藍色條帶到達凝膠底部，切斷電源，準備轉膜。將PVDF膜浸泡與甲醛中，然后在預冷的電轉緩沖液中處理5 min，將PVDF膜與凝膠貼合，不要產生氣泡，兩側覆蓋濾紙，轉膜；轉膜完畢后將PVDF膜浸泡與5%的脫脂奶粉溶液中，促進非特異性蛋白結合位點封閉；根據抗體說明書稀釋抗體，與PVDF膜4 ℃孵育過夜，37 ℃水浴復溫1 h，TBST漂洗2次，每次5 min，加入二抗，37 ℃孵育PVDF膜2 h，TBST漂洗2次，每次5 min，避光，加入ECL液孵育5 min，凝膠成像儀中拍照，Quantity One分析蛋白質灰度值。

2.7 統計學分析

3 結果

3.1 人參皂苷Rg3聯合紫杉醇對人肝癌細胞HepG2增殖的抑制作用

MTT結果如表1 所示，人參皂苷Rg3(10、15、30、60、120 μg/mL)聯合紫杉醇(80 μg/mL)分別處理肝癌HepG2細胞24、48、72 h后，對其增殖作用均有不同程度的抑制作用。與24 h處理組比較，紫杉醇聯合人參皂苷Rg3(30、60 μg/mL)在48、72 h后對肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用顯著升高(P<0.05)；與48 h處理組比較，紫杉醇聯合人參皂苷Rg3(30、60、120 μg/mL)在72 h后對肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 不同劑量人參皂苷Rg3聯合紫杉醇對人肝癌細胞HepG2各時間點的MTT結果

3.2 人參皂苷Rg3聯合紫杉醇對人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤體內抗腫瘤作用

各實驗組小鼠體內腫瘤的生長情況和腫瘤抑制率分別見圖1和圖2。由圖可見，相比于對照組，給予不同藥物處理均可抑制小鼠體內腫瘤的生長，其中聯合給藥組抑制作用最為明顯。由圖2可以看出，在給藥14 d后，人參皂苷Rg3聯合紫杉醇組腫瘤抑制率(64.13±2.02)%較人參皂苷Rg3組(48.34±3.86)%和紫杉醇組(54.21±3.21)%顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；在給藥28 d后，聯合組腫瘤抑制率(69.38±2.19)%較人參皂苷Rg3組(57.30±3.95)%和紫杉醇組(61.08±4.16)%顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各實驗組裸鼠移植瘤腫瘤體積

注：與人參皂苷Rg3組比較，*P<0.05,**P<0.01；與紫杉醇組比較，P<0. 05。圖2 人參皂苷Rg3聯合紫杉醇對人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤生長的抑制作用

3.3 人參皂苷Rg3聯合紫杉醇對人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤凋亡相關蛋白caspase-3、bac-2/bax表達的影響

Western blot實驗結果如圖3所示，從圖中可以看出，與對照組比較，聯合用藥組人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤凋亡相關蛋白caspase-3表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，聯合用藥組和紫杉醇組bac-2/bax表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

4 討論

肝癌又稱肝惡性腫瘤，是常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌患者死亡率約10萬人/年，僅居食管癌和胃癌之后，其年死亡率占全世界肝癌死亡率的45%，如果不及時給予救治，生存期僅0.7～8個月[7-9]。肝癌手術后期的治療多以放化療為主，紫杉醇為常見廣譜化療藥物[10-11]，與其他化療藥物一樣，紫杉醇在用于肝癌治療過程中，除殺死肝癌細胞外，還會影響機體的正常細胞甚至致其死亡[12-14]。因此，研究更多替代或者輔助化療的藥物，從而起到減毒增效的作用是當下研究的熱點問題[15-16]。

注：A：caspase-3、bcl-2、bax蛋白免疫印跡條帶；B：caspase-3、bcl-2、bax蛋白相對表達量分析；C：bcl-2/Bax蛋白相對表達量分析。與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與紫杉醇組比較，#P<0.05,##P<0.01。圖3 人肝癌裸鼠移植瘤caspase-3、bac-2/bax蛋白表達水平變化的免疫印跡分析

本研究選用人參皂苷Rg3聯合紫杉醇，通過體內外實驗考查其聯合肝癌的作用。通過MTT法檢測發現兩藥聯合可顯著抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，與單用紫杉醇相比，其抑制作用更加明顯，而抑制肝癌細胞增殖的作用在一定范圍內呈現出濃度依賴性關系，當給藥濃度超過一定范圍時，其抑制作用趨于平穩，這與鄭展等人[17]研究的結果一致。此外，通過作用于裸鼠移植瘤肝癌模型，發現隨著給藥時間的延長，人參皂苷Rg3聯合紫杉醇對于體內腫瘤的生長也具有顯著的抑制作用。為了從多方面探究兩藥聯合抗肝癌的作用機制，本研究進一步采用Western blot實驗檢測肝癌細胞凋亡相關蛋白caspase-3、bcl-2/bax的表達水平，結果顯示，聯合給藥組caspase-3蛋白表達顯著升高，bcl-2/bax顯著降低，推測人參皂苷Rg3聯合紫杉醇可通過caspase-3、bcl-2/bax信號通路誘導肝癌細胞的凋亡。

綜上所述，人參皂苷Rg3聯合紫杉醇可通過抑制肝癌細胞的增殖和誘導其凋亡達到協同抗腫瘤的效果，但是肝癌的形成、生長、發展和轉移機制復雜，不單與腫瘤細胞的增殖、凋亡相關，其他方面的作用還有待進一步研究。