載人航天器環境微生物免培養法檢測技術研究進展

辛冰牧，王 珩，徐 沖，趙 爽，張 紅，謝 瓊*

(1. 中國航天員科研訓練中心，北京100094； 2. 深圳綠航星際太空科技研究院，深圳518172)

1 引言

美俄載人航天的經驗證明，隨著飛行時間的延長，載人航天器座艙內微生物的危害會越來越嚴重[1-3]。 對人體而言，太空中的微生物危害主要是影響乘組健康，作為病原體引起感染、過敏，同時微生物能釋放有害氣體，成為間接的致病源[4-5]；對飛船系統而言，一些生物降解類微生物能夠降解飛船材料、腐蝕儀器儀表，可能影響航天器硬件設備穩定性，致使儀器及系統失靈等[5-6]。隨著各國深空探測計劃的實施，航天器飛行距離越來越遠，飛行時間越來越長，傳統以在軌培養為基礎的微生物檢測技術凸顯出不足之處，而新的檢測技術還不成熟，使得航天器環境微生物監測已成為載人航天領域關注和急需解決的問題。

2 載人航天器環境微生物監測發展過程

早在20 世紀60 年代，美俄研究者就意識到微生物對載人航天的影響[7]。 微生物作為重要的生物醫學問題，對其監測始于乘組健康的考慮。從阿波羅計劃開始，微生物的監測就納入了飛行任務，其目的是:①月球污染評估；②通過檢測潛在病原微生物，以早期確認相關醫學問題，采取預防措施；③從患病乘員身上分離臨床重要微生物，輔助診斷和治療；④收集微生物數據，闡明微生物種群對太空環境的反應性及評估其對乘組的影響。 在阿波羅計劃歷次飛行任務中，微生物監測僅限于飛行前和飛行后采樣及地面分析[8-9]。

與阿波羅任務不同，空間實驗室任務實現了在軌采樣，包括飛行前、中、后乘組自身微生物和座艙環境微生物采樣，采集樣品在地面檢測。 即，空間實驗室階段還未實現真正意義上的在軌微生物監測[10]。

和平號空間站進行了較細致的微生物檢測，包括空氣(12 個位置)、再生水、空氣冷凝物、表面(內飾、儀器等)。 空氣微生物采樣基本每月1次，至少不超過兩月1 次；采樣所需耗材由貨運飛船運送；由乘員在軌采集、培養、計數，并將結果在通話時間下傳地面；表面微生物樣本在每次飛行任務結束前采樣，樣本帶回地面分析[1]。

國際空間站是迄今為止最大的空間國際試驗平臺，微生物監控涉及的場景越來越多，已成為乘員健康保障系統的重要組成部分。 微生物監測與控制從飛行任務上主要包括空間站(長期駐留)、載人運輸飛船、貨運飛船的微生物監控；從范圍上主要包括環境(空氣、儀器表面和水)和人體；從項目上包括細菌、真菌、主要致病菌和原生生物；從時間上包括飛行前、中、后。 國際空間站微生物監控，飛行前、中在軌實時監測主要進行菌落計數；飛行前、中留樣還將進行地面深度檢測，包括細菌及真菌分類鑒定[11]。

從阿波羅計劃到國際空間站，在軌微生物檢測項目逐漸增加，在檢測方法上主要采用培養法進行座艙內微生物水平計數評估，深度的微生物種類鑒定則是通過把樣本送回地面得以實現。 為實現在軌實時鑒定，越來越多的非培養技術逐步在國際空間站這一實驗平臺開展驗證。

3 載人航天器環境微生物監測技術

3.1 基于培養法的微生物檢測

培養法是國際和國內疾控及環境質量監測采用的標準方法，載人航天器進行微生物檢測伊始就采用了此方法，至今仍是國際空間站進行環境微生物監測的常規方法。

微生物的監測依賴于可靠的采樣設備， 能夠準確定量微生物負荷(細菌、霉菌、酵母和真菌孢子)的測試方法及相應的評價標準。 由于受到太空失重及座艙資源的限制，樣本的采集方式和樣本的物理性狀是設計者不得不考慮的問題，培養法無疑是一種可靠的微生物定量方法。 該方法利用物理方式將樣本采集在固體營養介質上，在適宜的溫濕度條件下培養一定時間后，進行計數和后期的微生物鑒定。

1)空氣微生物采樣。 國際空間站空氣微生物采樣基于撞擊原理，從空氣流中分離氣溶膠粒子并撞擊在固體采樣瓊脂表面，達到捕獲微生物粒子的目的。 采樣器結構簡單、體積小、重量輕，噪音低，操作簡單，能夠滿足在軌采樣的需求。 捕獲的微生物粒子附著在固體營養瓊脂平板上，可直接放入培養箱進行培養。

2)表面微生物采樣。 國際空間站采用了接觸式營養平板，采樣時將采樣面直接覆蓋于采樣平面，就能夠達到捕獲微生物粒子的目的。 國際空間站也采用無菌棉拭子進行表面采樣，但棉拭子采集的樣本需要經過含水試劑溶解處理后方能進行培養，因此這種樣品只能帶回地面檢測。 除棉拭子采樣外，日本艙開展了用粘附紙片法進行表面微生物樣本采集的研究[12]。

3)水的微生物采樣。 國際空間站使用了采樣袋、微生物俘獲濾膜、廢水袋等組成的分體式密閉裝置，將微生物粒子捕獲在濾膜上，加注培養介質后進行培養計數。

“無產階級的運動是絕大多數人的，為絕大多數人謀利益的獨立的運動”[3]（P411）。中國共產黨自成立之日起，奮斗目標就是為了維護和實現大多數人的利益。以毛澤東為代表的早期共產黨人，為了中國人民的解放事業，把自己的畢生精力都獻給了革命事業，始終與人民保持著密切的聯系，形成了群眾路線，并在爭取到最大多數人民群眾支持和擁護的基礎上取得了新民主主義革命的勝利，建立了中華人民共和國，使廣大人民群眾實現了解放。

同時，NASA 對于國際空間站乘員艙內以上3類微生物規定了相應的限值標準[13]，為乘員艙環境微生物控制，保障乘員健康提供依據。

3.2 基于非培養法的微生物監測技術

依據國際空間探索協調組織(ISECG)發布的全球探索路線圖[14]，到2030 年，人類將進入火星軌道。 這就意味著人類將飛得更遠，飛得更久。無論是近地軌道飛行，還是深空探測，航天員均有醫學問題發生的風險，同時會發生適應太空環境的生理改變，乘組醫生需要與地面醫療相同的、依賴于分子水平的、準確實時的臨床數據進行診斷。

近年來，科學家們在微機電系統(MEMS)、納米技術和分子生物學領域取得了無可爭議的進步和突破，使復雜醫學檢測設備小型化、簡單化成為可能，以微流控技術、微機電技術、納米技術與分子生物學相結合為原理的醫學檢測設備紛紛登陸太空，為人類實施疾病診斷、尋找新基因、藥物篩選等提供操作平臺，為在軌實時檢測技術的發展提供理論基礎和技術支持。

3.2.1 基于磷脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的微生物檢測

2006 年11 月，基于鱟試劑的芯片實驗室(Lab-On-a-Chip Application Development Portable Test System，LOCAD-PTS)由STS-116 送入國際空間站，在2006 ～2009 年間進行評價試用，開展了對國際空間站表面微生物快速檢測的研究項目，使用儀器為便攜式發光檢測儀，原理是通過革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌細胞壁存在的特異組份磷脂多糖(內毒素)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid)、β-1，3-葡聚糖進行定量檢測(圖1)[15]。 該系統分為采樣(Swabbing Unit)、樣品預處理(Swabbing Kits)、加樣板(Cartridges)和檢測儀(Reader)4 部分組成，采樣器具有采樣、預處理和加樣功能； 預處理部分為預充無內毒素水的柱狀模塊，可與采樣器連接，通過采樣器按鈕將樣本混合，后連接加樣吸頭將樣本加注在加樣板上，進行檢測(圖2)[15]。 該系統為手持便攜儀器，優點是體積小，重量輕，同時檢測快速，15 min 出結果。但由于生物活性分子在不同類型微生物中分布差異較大，與培養法在結果上不對應；目前針對該法及國際空間站現行環境微生物控制要求，項目組已提出了相應判斷標準[16]。 在定性方面，該方法無法鑒定到某一屬、種。 目前該方法為試驗項目，由于采樣方法的局限，僅用于表面微生物檢測。

圖1 LOCAD-PTS 檢測原理圖[15]Fig.1 Schematic diagram of LOCAD-PTS test[15]

圖2 LOCAD-PTS 檢測設備及備件[15]Fig.2 Equipment and accessories of LOCAD-PTS test[15]

3.2.2 基于核酸的微生物檢測

2006 年歐洲航天局微重力應用計劃(European Space Agency Microgravity Applications Programme，ESA-MAP)資助SAMPLE 實驗項目，該項目使用定量實時PCR 法(Quantitative real time PCR， Q-PCR)與熒光原位雜交(Fluorescence in Situ Hybridization， FISH)法相結合，對國際空間站樣本進行檢測，建立了適于空間應用的采樣、DNA 分離技術；并設計包括人致病菌-金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、嗜肺軍團菌等在內的多個細菌的特異Q-PCR 引物探針[17]。 此外， Vesper 等[18]也使用了Q-PCR 方法對國際空間站樣本進行了產毒青霉菌等真菌的檢測，并指出Q-PCR 技術的在軌應用前景。

2016 年7 月20 日，由英國牛津納米孔技術公司研制的手持式DNA 測序以MinION 由SpaceX 公司天龍號太空補給飛船運至國際空間站，NASA 航天員Kathleen Rubins 成為第一個進行在軌DNA 測序的人，她對小鼠、大腸桿菌和噬菌體病毒DNA 進行了測序。 目的是證實在太空進行DNA 測序是可行的，進而實現在軌微生物鑒定、檢測太空飛行對微生物和人體的影響及尋找和發現地外生命的目的。 此次實驗使用地面事先準備好的的DNA 樣本[19]。 與其他非培養法實現在軌檢測的困難相同，核酸法在軌檢測前需要進行DNA 提取、擴增等操作，由于受到失重條件的限制，地面核酸樣本的處理方法無法在太空中直接應用。 NASA 開放了一套新型的分子生物學實驗系統Wetlab-2， 專門設計用于微重力條件下處理生物樣本，在軌進行實時基因表達分析。 這套系統包括液體RNA 樣本制備模塊、流體傳輸裝置、一體式凍干PCR 分析儀、離心機和實時PCR熱循環儀(圖3)。 該系統2016 由SpaceX CRS-8貨運飛船送至國籍空間站，在4 ～5 月間開展相應研究[20]。 國際空間站開展的基因-3 項目，將樣本處理與MinION 檢測連接，首次完成在軌從樣本到微生物鑒定全過程操作。 但該項目樣本仍來源于平板培養后的菌體樣本[21]。 NASA 項目主管微生物學家Wallace 博士表示“下一步將在太空完成整個測序過程，不再帶樣本到太空，而是由航天員在太空取樣、預處理，然后進行基因測序”。

圖3 Wetlab-2 系統操作流程圖[20]Fig. 3 Operational flowchart of Wetlab-2 system[20]

2011 年，由北京理工大學團隊研制的微流控芯片基因擴增裝置，在神舟八號成功搭載并圓滿完成空間生物實驗研究，實現了中國微流控芯片技術在太空領域的應用。

測序儀不但可以成為快速準確的診斷設備，同時也是科研的重要研究工具，如直接檢測繞軌飛行中遺傳物質表達的變異，而不是返回地面分析后才知道結果，這將對未來長時間飛行的深空探測發揮重要作用。

3.2.3 基于ATP 的微生物檢測

早在20 世紀60 年代，ATP 法已用于評估工業環境衛生質量，其原理是使用化學發光檢測儀特異檢測微生物細胞內的ATP，從而確定微生物總數。 目前已有市售商品，這類產品體積小、重量輕、操作簡便、檢測快速。 用于表面微生物檢測時，只需用專用棉拭子擦拭采樣區域，再與含細胞裂解成分的試劑混合數分鐘即可檢測，整個過程不超過5 min。 在20 世紀80 年代，ATP 法被認為是最便捷、可靠的評估多數環境微生物總數的方法[22]。 La Duc 等[23]使用培養法、ATP 法、Lps 法及DNA 法檢測空間站樣本的比較研究中指出，ATP 法靈敏度高，以ATP 法檢測國際空間站表面微生物樣本，檢測的微生物總數至少高于培養法2～3 個數量級；但這也是其缺點所在，因無法增殖的死亡細菌也含有ATP，因此該方法無法區分死亡和有增殖能力的微生物，這也是其檢測在數值上明顯高于培養法的原因之一；此外ATP 法只能評估環境樣本的微生物總數，無法作分類鑒定。

ATP 法在NASA 目前主要用于行星保護計劃，該方法也列入了MARs 計劃，用于快速檢測外太空的生命體。

3.2.4 基于微流控技術的微生物檢測

流式細胞儀其靈敏、快速檢測的特性，被認為在某種程度上可以代替熒光顯微鏡。 但地面上所使用的流式細胞儀操作復雜，有時需要具有專業技術的人員完成檢測。

2012 年9 月至2013 年9 月，由加拿大太空局(CSA)資助、來自于加拿大INO 公司基于微流技術的小型流式細胞儀(Miniaturized flow cytometer)在ISS 開展實驗；該項目旨在評估微流技術在太空環境的可應用性；該技術對于進行生理和生物學研究，實施在軌醫學監測具有重要價值[24]。

小型流式細胞儀在太空的應用前景包括:可以使用少量血液或其他體液樣本，通過快速病毒和細菌鑒定，血球計數實時檢測診斷感染性疾病；通過檢測血中類胰蛋白酶水平診斷過敏性疾病；通過檢測酶，膽紅素和血細胞計數評價肝臟功能，判斷肝臟損傷；通過檢測血中輻射相關生物標記物和染色體變異(核型)判斷輻射暴露損傷；通過尿中血細胞檢測診斷腎結石；通過快速檢測血中肌鈣蛋白對心肌梗塞進行診斷等。 同時，人體對于太空環境的生理適應性反應也可以通過這種具有實時分析能力的設備得到跟蹤研究。 流式細胞儀支持以下人體生理功能檢測:生理改變包括骨丟失、肌肉萎縮、心血管適應性改變及貧血；應激水平包括血液中激素水平；免疫功能包括免疫細胞數量及活化狀態等。

4 討論

一種既有效又可靠的載人航天器在軌微生物檢測方法，應具備以下特點:①滿足失重環境下使用；②自動化程度高，對航天員的操作需求小；③一次操作能正確定量和區分多種微生物；④完成檢測依賴的資源少，能耗小。

目前載人航天器所使用的環境微生物檢測方法主要為培養法。 培養法有準確性高、較直觀、判讀標準較成熟等優點，但也有明顯的缺點:①在軌培養有一定的生物學危險性。 ②需要采樣和培養設備，占用資源較多。 ③培養需時間較長，判讀結果有延遲性；依據國際空間站醫學操作需求文件(ISS Medical Operation Requirement Document，MORD)，空氣和表面樣本需在軌培養5 d后進行菌落計數。 ④只能作總數監測，無法進行分類鑒定；國際空間站在軌微生物檢測中，只有水中腸菌通過將水采集在預裝了鑒定培養基的分析袋中，經培養后顏色變化，鑒定腸菌是否超標，但也無法區分腸菌類別；俄羅斯SM 艙采用了通過肉眼觀察，對平板培養的菌落進行形態學分類的鑒定方式，將細菌分為生孢菌、腸菌、革蘭氏陰性菌等，將真菌分為亮色和暗色兩種，這種方法比較粗略，且需一定背景知識；大量的樣本還是需帶回地面進行分析鑒定。 ⑤培養法可能會低估微生物種群的數量，因為某些微生物需非培養或特殊培養條件。研究顯示，僅1%的微生物是可培養的。 使用培養法在國際空間站樣本中檢出桿菌屬是主要存在的細菌，但非培養法檢測顯示國際空間站存在大量革蘭氏陰性和陽性菌；同樣，國際空間站未培養得到水中微生物，但DNA 檢測發現國際空間站水樣中存在大量條件致病菌的核酸序列。

近年來新的檢測技術不斷涌現，以滿足空間站檢測的實際需求，其中包括基于ATP 微生物檢測方法、基于LPS 微生物檢測方法、基于核酸的檢測方法等，以內毒素、葡聚糖、表面抗原、大分子生物標志物等細菌和真菌活性分子為基礎的、非培養、便攜式微生物檢測技術研究已成為微生物領域的熱點。 這類檢測方法的優點包括(表1):①檢測快速，可在幾小時、甚至幾分鐘內出結果，如ATP、LPS 法僅需數分鐘即可完成檢測，核酸檢測可在數小時內完成檢測；②避免了有活性的微生物增殖，生物危險性低；③自動化程度高。 但也存在以下問題:①樣本的采集、預處理及檢測過程的失重環境適應性，是其在軌應用需要解決的首要的、關鍵的問題；如基于核酸的檢測技術雖被普遍看好，但由于其樣本處理涉及液體操作界面，在前面提到的項目絕大多數尚處在地面研究或在軌驗證階段，未實現在軌應用。 ②以內毒素、葡聚糖、表面抗原、ATP 等生物標志物為靶點的檢測方法，由于生物活性分子在不同類型微生物中分布差異較大，在定量上很難與實際菌落數形成一對一，或相應的比例關系，其判讀標準的制定，即載人飛行器環境微生物衛生學標準的制定也是需要解決的關鍵問題，該問題解決最好的是基于LPS 檢測的LOCAD-PTS 項目。 ③以ATP、DNA 等方法檢測，無法區分死亡和有增殖能力的微生物，這會給座艙微生物的危害評估帶來困難，在環境微生物數量評估方面還無法取代培養法。

表1 環境微生物檢測方法比較Table 1 Comparison of detection methods for environmental microbes

5 結論

1)以非培養法為基礎的檢測技術和便攜式微生物檢測設備研究很具有發展前景，但目前技術上尚不成熟，實現在軌應用還有距離；在計數評價座艙環境微生物負荷方面，尚無法取代培養法，應用中可考慮與培養法的結合使用，以達到在軌檢測微生物的準確性、全面性。

2)載人航天器微生物檢測技術隨著載人航天事業的發展不斷進步，正在從對座艙環境微生物單純在軌計數評價，逐步實現計數與微生物鑒定相結合的綜合評價，這將為未來深空探測乘員感染性疾病診斷，對空間微生物生物學特性變化開展實時研究及地外原位生命發現與行星保護提供技術支持。