結直腸癌組織中CD133及LGR5蛋白的表達及差異表達基因分析 *

周龍翔，饒雷平，俞 冬，徐 軍，吳忠新，疏東升

1.上海健康醫學院附屬上海市第六人民醫院金山分院，上海 201599；2.上海市松江區泗涇醫院，上海 201601

結直腸癌是全球常見的三大癌癥之一，給社會帶來巨大的經濟損失[1]。統計數據及資料表明，截至2012年，全球有130萬人被確診為結直腸癌相關疾病[2]。結直腸癌的早期臨床癥狀隱匿，目前常用的腫瘤標志物如癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)199等，其靈敏度不高，且對腫瘤的預后評估價值有限，尋找新的結直腸癌腫瘤標志物變得極為迫切。在大腸癌腫瘤細胞中可能存在著少量具有干細胞樣特性的腫瘤干細胞，而這些腫瘤干細胞的存在是造成腫瘤耐藥性增高和惡性增殖的主要原因。研究表明，CD133、LGR5蛋白[3-5]是腫瘤干細胞相關的表面標志物，參與腫瘤的形成、轉移、復發和治療抵抗[6-7]，CD133和LGR5基因及蛋白的陽性表達與胃腸道疾病的發生、發展有關[8]。本研究采用免疫組化法檢測結直腸癌、結直腸息肉及正常結直腸黏膜組織中CD133和LGR5蛋白的表達，并分析其相關性。同時，本研究采用生物信息學手段分析結直腸癌細胞轉錄組數據，進行差異表達基因篩選，分析CD133及LGR5基因表達與結直腸癌伴肝轉移、結直腸癌細胞侵襲性及患者生存率的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 結直腸息肉、腫瘤組織和正常結直腸黏膜組織標本均來自上海健康醫學院附屬上海市第六人民醫院金山分院消化內鏡室2014年8月至2015年12月行結腸鏡檢查或治療的患者。共收集結直腸癌組織13例(其中男6例、女7例，中位年齡64歲)，結直腸息肉組織12例(其中男9例、女3例，中位年齡62歲)，結腸鏡檢查且組織病理學檢查均為正常的結直腸黏膜組織12例(其中男8例、女4例，中位年齡58歲)。

1.2主要試劑 兔抗人CD133多克隆抗體(濃縮型),兔抗人LGR5多克隆抗體(濃縮型)，二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒，山羊超敏二步法免疫組化檢測試劑，免疫組化用磷酸鹽緩沖液(PBS)，抗原修復液。

1.3方法

1.3.1免疫組化法 采用免疫組化試驗和顯微鏡觀察技術，探討結直腸腫瘤組織中CD133及LGR5蛋白的表達，所有病理切片均由兩名病理學專家獨立分析。

1.3.1．1標本處理 所有標本固定于10%甲醛中，石蠟包埋后保存備用。

1.3.1.2HE染色 首先將各種類型組織連續切片，進行二甲苯脫蠟、乙醇水合，用蘇木素染細胞核5 min，蒸餾水沖洗，氨水返藍1 min后蒸餾水沖洗，用伊紅染細胞質3 min，蒸餾水沖洗，95%乙醇分化30 s，最后用二甲苯透明15～20 min后封片，在顯微鏡下觀察、攝片。

1.3.1.3免疫組化染色 先進行預實驗，根據染色效果確定CD133和LGR5第一抗體最佳水平。染色具體步驟：(1)脫蠟脫水處理。石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min，之后放入無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇各5 min，PBS浸泡10 min。(2)內源性過氧化物酶活性去除。將玻片置于3% H2O2溶液10 min，隨后PBS洗3次。(3)抗原修復。將玻片置入枸櫞酸鈉緩沖液(SSC，pH6.0)，微波爐加熱10 min。隨后，冷卻至室溫后PBS沖洗3 min。(4)加一抗。分別滴加CD133、LGR5抗體，然后置于4 ℃冰箱，孵育24 h。37 ℃溫箱中復溫15 min。用PBS沖洗3次，各3 min。(5)加二抗，方法同前。(6)二氨基聯苯胺(DAB)顯色。用DAB溶液進行孵育顯色，顯微鏡下檢查染色深淺。(7)蘇木素復染細胞核，逆酒精梯度脫水，二甲苯透明，在顯微鏡下觀察后中性膠封，在顯微鏡下觀察、攝片。

1.3.1.4免疫組化染色讀片 在結直腸組織中，CD133蛋白以細胞膜染色為主，細胞質有少量染色，呈棕黃色為陽性染色；LGR5蛋白以細胞質染色為主，呈棕黃色為陽性染色。高倍鏡下(×400)每張切片隨機選擇5個視野，進行視野內細胞計數，并計算陽性細胞所占比例。細胞無著色為(-)；<25%的細胞著色為(+)；25%～50%的細胞著色為(++)；>50%的細胞著色為(+++)。

1.3.2生物信息技術分析結直腸癌轉錄組數據庫

1.3.2.1生物信息數據庫 差異表達基因分析所用數據庫1：GSE2509(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE2509)。差異表達基因分析所用數據庫2：GSE21510(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE 21510)。從中獲取癌癥組及正常對照組的資料。大腸癌及結直腸癌肝轉移表達分析所用數據庫3：GSE72718(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE72718)。從中獲取結直腸癌組及結直腸癌伴肝轉移組的資料。生存曲線分析所用數據庫4：GSE12945(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE12945)。

1.3.2.2分析方法 挑選GSE2509轉錄組數據[9]，包括3例SW480細胞系和3例SW620細胞系轉錄組表達譜。利用GEO2R在線分析及R語言包分析，篩選出差異表達基因，并對差異有統計學意義的基因進行功能聚類分析(GO分析和KEGG分析)。篩選條件|log2Fold Change|≥1，Padjust <0.05。然后，利用GSE12945數據庫[10]對CD133和LGR5基因表達與結直腸癌生存情況之間的關系進行分析。

2 結 果

2.1免疫組化法分析結直腸相關病理組織中CD133蛋白和LGR5蛋白表達水平

2.1.1CD133蛋白在各組織中的表達 通過免疫組化染色，觀察正常結直腸、結直腸息肉、結直腸癌組織中CD133蛋白的表達。結果表明，CD133蛋白在正常結直腸組織中陽性率為33.3%(4例)，在結直腸息肉組織中陽性率為25.0%(3例)。但是在結直腸癌組織中，其陽性率高達76.9%(10例)，高于正常結直腸組織和結直腸息肉組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為正常結腸；B為正常直腸；C為結直腸息肉；D為結直腸癌。

2.1.2LGR5蛋白在各組織中的表達 通過免疫組化染色，觀察正常結直腸、結直腸息肉、結直腸癌組織中LGR5蛋白的表達。結果表明，LGR5蛋白在正常結直腸組織中陽性率為41.6%(5例)，在結直腸息肉組織為50.0%(6例)。但是在結直腸癌組織中，其陽性率為69.2%(9例)，高于正常結直腸組織、結直腸息肉組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為正常結腸；B為正常直腸；C為結直腸息肉；D為結直腸癌。

2.2信息技術分析、篩選結直腸癌相關的差異表達基因

注：A、B為GSE21510數據庫中CD133及LGR5基因的表達水平比較;C、D為GSE72718數據庫中CD133及LGR5基因的表達水平比較。

2.2.1篩選差異表達基因 GSE2509數據庫中篩選出差異表達基因1 265個(上調基因524個，下調基因741個)，其中顯著差異表達的基因有MICU3、SOX2-OT、ANKRD44、SYCP2、CD133、BPIFB1、HS6ST2、LGR5等。并以此繪制熱圖、火山圖。然后對CD133和LGR5基因表達水平進行分析。與初代結腸癌SW480細胞系相比，在強侵襲性的結腸癌SW620細胞系中CD133和LGR5基因mRNA表達量均顯著升高。此外，本研究還分析了GSE21510與GSE72718數據庫中骨保護素在人大腸癌中表達及結直腸癌伴肝轉移表達的公共數據，用于支持GSE2509數據庫結直腸癌CD133、LGR5基因表達水平變化的結果，結果發現，GSE21510數據庫中癌癥組CD133和LGR5基因的表達水平均顯著高于正常對照組(P<0.05)；GSE72718數據庫中僅有結直腸癌伴肝轉移組CD133基因的表達水平顯著高于結直腸癌組(P<0.05)，而LGR5基因的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.2.2對篩選出的1 265個差異表達基因進行GO分析和KEGG分析 利用R語言包進行功能富集分析，GO分析富集到MF通路180條，BP通路1 673條，CC通路156條；KEGG分析中50條分子信號通路被顯著富集。

2.2.3CD133和LGR5基因表達水平與結直腸癌患者生存率之間的相關性分析 對GSE12945數據庫中結直腸癌腫瘤組織表達水平與患者生存率之間的關系進行分析，發現CD133和LGR5基因mRNA表達水平與結直腸癌患者總體生存率無顯著相關性(P>0.05)。見圖4。

注：圖中數據來自GSE12945數據庫；A為CD133基因；B為LGR5基因。

3 討 論

目前，結直腸癌腫瘤細胞分子標志物已有許多報道，例如：CD133、CD29、CD44、CD166(ALCAM)、EpCAM、ALDH1A1、ALDH1B1、LGR5等[11]。CD133蛋白是表達于細胞表面的一種跨膜糖蛋白，其生物學功能與結直腸癌腫瘤的形成和發展密切相關，但具體作用及分子機制尚不清楚。ZHAO等[12]對CD133基因的表達水平進行了分析，發現CD133基因高表達與TNM分期、淋巴結轉移密切相關。LUKA等[8]的研究表明，CD133基因和蛋白高表達的結直腸癌患者預后差，復發和轉移的概率較大。HUANG等[13]的Meta分析進一步說明了CD133蛋白是結直腸癌發展和判斷預后的分子標志物，可用于臨床檢測和靶向治療，具有重要的潛在應用價值。LGR5蛋白是位于細胞膜中的一種G蛋白偶聯受體，其在結直腸癌的發展過程中起著重要作用，然而具體特性和功能尚不清楚[4-5]。在結直腸癌腫瘤組織中，LGR5基因的表達水平明顯高于對照組的正常黏膜組織，且其表達強度與結直腸癌患者預后密切相關[5]。KLOSE等[14]研究表明，沙利霉素具有抑制結直腸癌的作用，而且LGR5基因作為Wnt/β-連環蛋白信號通路下游的靶基因之一，參與這一過程。當沙利霉素作用于結直腸癌細胞時，抑制了包括LGR5基因在內的Wnt/β-連環蛋白信號通路及其下游信號轉導，進而起到抗腫瘤作用。因此，CD133和LGR5基因和蛋白均是結直腸癌腫瘤發展及判斷預后的重要分子標志物。

腫瘤細胞本身具有異質性和多樣性的特征，即使同一種腫瘤細胞也會擁有多個標志物，單一的分子標志物無法滿足臨床診斷的精確性需求，因此需要選取2個及以上分子標志物提高診斷精確度。前人的研究已經表明CD133和LGR5蛋白均為腫瘤干細胞的分子標志物[8]。本研究中，筆者分析了結直腸癌分子標志物CD133和LGR5蛋白表達情況及與腫瘤發展及預后之間的相關性。本研究發現，與正常結直腸組織相比，結直腸癌組織中CD133和LGR5蛋白陽性率顯著升高，結果與前人研究結果一致[13-14]。同時，本研究挑選CD133和LGR5基因，與SW480細胞系相比，在強侵襲性的SW620細胞系中CD133和LGR5基因mRNA表達量均明顯升高，這提示CD133和LGR5基因高表達則腫瘤侵襲性越強。利用GSE12945數據庫對CD133和LGR5基因進行生存曲線分析，發現這些基因表達量變化對結直腸癌患者的生存率沒有顯著影響(P>0.05)，但數據庫相關病例數較少，這需要更多臨床大樣本數據進行分析。筆者推測，結直腸癌的發生、發展是通過多個基因以及相關信號通路共同發揮作用，而非單一基因表達水平變化造成的，同時結直腸癌的治療措施增多，對患者預后也產生了積極的影響。

本研究結合高通量測序數據庫和生物信息技術對結直腸癌發生過程中的分子標志物進行了探討。首先，采用GSE2509數據庫篩選差異表達基因，獲得差異表達基因1 265個。于是，對這1 265個差異表達基因進行功能富集分析，其中GO分析顯著富集到2 009條通路，KEGG分析顯著富集到50條通路。差異表達基因主要富集在腫瘤的灶性黏附、轉錄調控失調、蛋白多糖信號通路中。同時為了驗證GSE2509數據庫得出的推論，本研究又挖掘了另一個大腸癌相關GE21510數據庫,通過表達量分析發現與正常對照標本相比，CD133及LGR5基因的表達量在癌組織中顯著高表達，進一步證明了腫瘤發病與CD133及LGR5基因高表達之間的相關性。同時本研究還對GSE72718數據庫進行了分析，結果發現，相對于原發性無轉移結直腸癌，CD133基因水平在結直腸癌伴肝轉移中顯著升高(P<0.05)，而LGR5基因水平略有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。這提示了CD133基因高表達與腫瘤侵襲性之間的相關性。

綜上所述，CD133和LGR5基因和蛋白在結直腸癌組織高表達，且與腫瘤侵襲性相關，相關的分子機制需要更深入的研究。