補(bǔ)腎活血祛瘀法對(duì)早期閉合性骨折模型大鼠愈合程度及血管新生的影響及作用機(jī)制

王飛，付霆

(湖北省武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430022)

閉合性骨折是指骨折處不與外界相通，黏膜或皮膚完整的骨折。骨折愈合是指骨折斷端間的組織修復(fù)反應(yīng)，是恢復(fù)骨的正常結(jié)構(gòu)和正常功能的愈合反應(yīng)[1-2]。中醫(yī)認(rèn)為骨折愈合是“瘀祛、新生、骨合”的過程，血瘀始終貫穿于骨折的整個(gè)過程，而腎虛血瘀為主要臨床證型，治療易補(bǔ)腎活血祛瘀[3]。中醫(yī)藥在其治療歷史悠久，療效良好，具有顯著優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)對(duì)骨折治療以活血化瘀藥為主[4]。補(bǔ)腎活血祛瘀法方為我院內(nèi)制劑，具有補(bǔ)腎活血去瘀、消腫止痛之功效，用于骨折、脫臼與軟組織扭挫傷，在我院取得良好的臨床療效。本研究通過建立閉合性骨折模型，探討補(bǔ)腎活血祛瘀法對(duì)早期閉合性骨折大鼠愈合程度及血管新生的影響及作用機(jī)制，旨在為臨床提供治療參考。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，雌雄各半，由上海耀源生物科技有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(滬)2019-0024。

1.2 藥品與試劑

3%戊巴比妥鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；血栓素B2(TXB2)和6-酮前列腺素F1(F1 6-Keto-PGF1)ELISA試劑盒(解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所)；麝香接骨膠囊(吉林龍?zhí)┲扑幑煞萦邢薰荆?hào)：190123)；補(bǔ)腎活血祛瘀方為本院協(xié)定處方，其組成為：淫羊藿30 g，熟地黃20 g，川續(xù)斷、紅花、當(dāng)歸尾、白芍、丹參各15 g，骨碎補(bǔ)10 g，三七9 g，甘草6 g。藥材均為本院中藥房提供，加8倍量水煎煮2次，濾過，濃縮成0.25 g/mL的煎煮液，放涼后待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SA-5600型全自動(dòng)血流變儀(上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司)；HD-310A/HD-310B 自動(dòng)包埋機(jī)(湖北慧達(dá)儀器有限公司)；TD5A-WS/TD5AWS型低速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)有限公司)；DG-3022型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(日本OLYMPUS公司)；BXS05-SN-6105型放射免疫計(jì)數(shù)器(北京北信科儀分析儀有限公司)；超低溫冰箱(冠森生物科技(上海)有限公司)。

1.4 造模與分組

按照體質(zhì)重隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽性組、試驗(yàn)組，每組15只。對(duì)照組未經(jīng)任何處理，其余各組參考文獻(xiàn)[5]制定閉合性骨折模型，即3%戊巴比妥鈉腔注射麻醉大鼠，局部脫去大鼠腿毛，三點(diǎn)受力原理，借專用的骨折器模擬長(zhǎng)骨干骨折時(shí)的受力造成脛骨閉合性骨折模型，不予固定，縫合傷口。骨折后的大鼠放置籠中自由活動(dòng)和進(jìn)食。建模成功后，陽性組給予麝香接骨膠囊0.5 g/kg灌胃；試驗(yàn)組給予補(bǔ)腎活血祛瘀法方灌胃，劑量2.5 g/kg，連續(xù)6周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 骨折處組織病理以及骨痂微血管測(cè)定

4周后處死大鼠，取骨折處上下各0.5 cm骨標(biāo)本，10%甲醛固定7 d， Jenkins混合脫鈣液脫鈣，乙醇脫水，置于已熔化的石蠟中進(jìn)行包埋，切厚5 μm切片放于載玻片上， 45 ℃恒溫箱中烘干，脫蠟染色。10×10倍光鏡下鏡檢，并隨機(jī)抽取5個(gè)視野計(jì)算毛細(xì)血管數(shù)，求均值，單位%。

1.5.2 骨折區(qū)組織質(zhì)量

處死大鼠后，取3份骨折組織進(jìn)行稱量，取平均值。

1.5.3 血清骨鈣素、Ⅰ型膠原以及血清VEGF檢測(cè)

取腹主動(dòng)脈血3 mL， 4 ℃下，離心(3 000 r/min)5 min，取上清液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清骨鈣素、Ⅰ型膠原和血清VEGF含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.4 血漿TXB2、6-Keto-PGF1的檢測(cè)

取3 mL腹主動(dòng)脈血，加入到肝素鈉混勻，離心(4 ℃，3 000 r/min，15 min) 分離血漿，置-20 ℃冰箱保存，采用ELISA 法檢測(cè)TXB2、6-Keto-PGF1 ，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.5 血液黏度檢測(cè)

腹主動(dòng)脈取血5 mL加入到肝素鈉混勻，采用SA-5600型全自動(dòng)血流變儀檢測(cè)大鼠全血黏度和血漿黏度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨折愈合和血管新生情況

與對(duì)照組比較，模型組大鼠的骨折面缺損明顯形成，即造模成功。給予藥物干預(yù)后，陽性組和試驗(yàn)組大鼠缺損毛細(xì)血管以及靜脈新生，且已有大量成骨細(xì)胞的形成，而試驗(yàn)組大鼠的骨折面中的骨小梁和骨性骨痂的形成明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠閉合性骨折愈合程度及骨痂微血管新生情況的影響(HE，×400)

2.2 Ⅰ型膠原含量、骨鈣素含量以及骨折區(qū)組織質(zhì)量情況比較

14 d后，模型組大鼠的Ⅰ型膠原含量和骨鈣素含量水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。給予藥物治療后，陽性組和試驗(yàn)組Ⅰ型膠原含量、骨鈣素含量以及骨折區(qū)組織質(zhì)量明顯低于模型組(P<0.05)，兩組間的血清Ⅰ型膠原含量、骨鈣素含量比較具有顯著性差異(P<0.05)，兩組間的骨折區(qū)組織質(zhì)量比較無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

2.3 TXB2、6-Keto-PGF1α水平以及TXB2/6-Keto-PGF1α比較

14 d后，模型組的血清TXB2水平和TXB2/6-Keto-PGF1α水平明顯高于對(duì)照組，血清6-Keto-PGF1α水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。給予藥物治療后，陽性組和試驗(yàn)組TXB2和TXB2/6-Keto-PGF1α明顯低于模型組，血清6-Keto-PGF1α水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，兩組間的血清TXB2、6-Keto-PGF1α水平以及TXB2/6-Keto-PGF1α具有顯著性差異(P<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠的Ⅰ型膠原含量、骨鈣素以及骨折區(qū)組織質(zhì)量情況比較

表2 各組大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α和TXB2/6-Keto-PGF1α比較

2.4 血液黏度比較

14 d后，模型組的全血黏度和血漿黏度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。給予藥物治療后，陽性組和試驗(yàn)組全血黏度和血漿黏度明顯低于模型組(P<0.05)，兩組間的全血黏度和血漿黏度比較具有顯著性差異(P<0.05)，見表3。

表3 兩組血液黏度指標(biāo)比較

2.5 血清VEGF和骨痂微血管數(shù)比較

14 d后，模型組的血清VEGF水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。給予藥物治療后，陽性組和試驗(yàn)組VEGF水平明顯低于模型組，骨痂微血管數(shù)明顯低于模型組(P<0.05)，兩組間的血清VEGF和骨痂微血管數(shù)比較具有顯著性差異(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠的血清VEGF和骨痂微血管數(shù)比較

3 討論

骨折是骨的完整性和連續(xù)性中斷，可引起骨折部位局部變形、腫脹、移動(dòng)劇痛以及瘀血等情況，可限制患者運(yùn)動(dòng)，嚴(yán)重影響其日常生活。血清骨鈣素在調(diào)控軟骨礦化發(fā)揮重要作用，Ⅰ型膠原表達(dá)的增加可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖分化，有利骨折組織修復(fù)[6]。血小板聚集的分子調(diào)節(jié)機(jī)制主要為TXA2和PGI2，TXA2通過抑制腺苷酸環(huán)化酶或促進(jìn)Ca2 +內(nèi)流促使血小板聚集和局部血管收縮，加速血栓形成。PGI2做為最強(qiáng)血管擴(kuò)張劑和血小板抑制劑，通過抑制血小板的聚集和協(xié)同擴(kuò)張血管，進(jìn)而降低血液黏稠度，促進(jìn)消除瘀血。TXB2為TXA2的代謝產(chǎn)物，6- Keto- PGF1α是PGI2的代謝產(chǎn)物，可間接血小板聚集水平，了解血液凝集狀態(tài)[7-8]。VEGF為促血管形成因子，不僅能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管重建，還能夠增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活性，其他促血管生成因子的血管重建作用的實(shí)現(xiàn)均與VEGF有關(guān)[9]。

中醫(yī)認(rèn)為骨折后血瘀積于經(jīng)脈不散，致使經(jīng)脈受阻，影響骨折愈合的速度；肝腎與骨生長(zhǎng)具有密切的相關(guān)性，中醫(yī)認(rèn)為，肝主筋，腎主骨生髓，因此，調(diào)節(jié)肝腎可以增加精血對(duì)骨折組織的濡養(yǎng)，治療應(yīng)該補(bǔ)腎活血化瘀。補(bǔ)腎活血祛瘀法以補(bǔ)腎活血化瘀藥為主，其中淫羊藿、川續(xù)斷、骨碎為補(bǔ)腎藥物，熟地黃、紅花、當(dāng)歸尾、白芍、丹參、三七、甘草為活血化瘀藥。相關(guān)研究已證實(shí)，在骨折治療過程中，加用補(bǔ)腎生髓藥可促使骨折愈合[10]。現(xiàn)代藥理學(xué)顯示[11-15]，丹參有效成分丹參酮IIA、丹參素、丹酚酸B和兒茶醛等，可促進(jìn)骨形成、間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨折愈合、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞和抗骨組織以及無機(jī)元素代謝紊亂的作用；當(dāng)歸有效成分可直接作用于骨髓細(xì)胞，改善血細(xì)胞的生產(chǎn)環(huán)境，并有顯著的止血止痛作用；三七有效成分三七總皂苷有效地抑制骨折后血液高凝狀態(tài)，保護(hù)血管內(nèi)皮，增加骨組織中b-FGF和VEGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合；紅花有效成分紅花黃色素可降低血漿黏稠度，有效地抑制血小板聚集，降低血小板內(nèi)游離鈣離子濃度，促進(jìn)骨折患者圍術(shù)期炎性反應(yīng)因子的清除。近年研究發(fā)現(xiàn)[16]，桃紅四物湯對(duì)脛骨閉合性骨折具有很好的祛瘀生新作用，其作用機(jī)制可能與改善血液黏度減低TXB2/6-Keto-PGE1α，促進(jìn)VEGF的表達(dá)有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的骨折面缺損明顯形成，即造模成功,Ⅰ型膠原含量、骨鈣素含量水平明顯高于對(duì)照組。給予藥物干預(yù)后，陽性組和試驗(yàn)組大鼠缺損毛細(xì)血管以及靜脈新生，且已有大量成骨細(xì)胞的形成，Ⅰ型膠原含量、骨鈣素含量明顯低于模型組，而試驗(yàn)組大鼠的骨折面中的骨小梁和骨性骨痂的形成明顯。提示補(bǔ)腎活血祛瘀法可促進(jìn)早期閉合性骨折模型大鼠愈合。與對(duì)照組比較，模型組大鼠的血清TXB2水平、TXB2/6-Keto-PGF1α水平、全血黏度和血漿黏度明顯高于對(duì)照組，血清6-Keto-PGF1α水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。藥物干預(yù)后，陽性組和試驗(yàn)組大鼠缺損毛細(xì)血管以及靜脈新生，且TXB2和TXB2/6-Keto-PGF1α和血黏度、血漿黏度明顯低于模型組，血清6-Keto-PGF1α水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，兩組間比較均有顯著性差異(P<0.05)。提示補(bǔ)腎活血祛瘀法可促使早期閉合性骨折模型大鼠降低血液黏度，促使血管新生。

綜上所述，補(bǔ)腎活血祛瘀法可提高早期閉合性骨折模型大鼠Ⅰ型膠原含量和骨鈣素含量，提高骨折愈合度，降低血液黏度，降低TXB2/6-Keto-PGE1α比值，促使血管新生。