斜紋夜蛾核多角體病毒Splt75基因的生物信息學分析

李賽男，呂怡娜，甘田，劉文華

（肇慶學院生命科學學院，廣東肇慶 526061）

桿狀病毒是一類特異性感染節肢動物的病原微生物，其典型特征是具有雙向復制周期，在復制周期中產生兩種不同形態和功能的病毒粒子，分別為芽生型病毒粒子（Budded virion，BV）和包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virion，ODV）。這兩種病毒粒子的囊膜結構和組分不同，但是核酸相同以及核衣殼組成相近[1-3]。BV負責建立系統感染，ODV負責在昆蟲宿主中的水平傳播[3-8]。桿狀病毒在應用上主要作為外源基因的高效表達載體和生物殺蟲劑[9]。

斜紋夜蛾（Spodoptera litura）俗稱夜盜蟲、黑頭蟲，又名蓮紋夜蛾，屬鱗翅目夜蛾科，是一種雜食性農業害蟲，危害的植物達到109科389種，在亞洲、非洲、歐洲、大洋洲等地均有分布，經常造成大范圍的嚴重災害[10]。目前，斜紋夜蛾的防治方式主要有生物防治、誘殺成蟲和化學防治等。斜紋夜蛾核多角體病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV）能特異高效地控制斜紋夜蛾種群，已被中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室開發成為商品化病毒殺蟲劑[11]。桿狀病毒作為生物殺蟲劑，相較于化學殺蟲劑具有其獨特的優點：宿主專一不傷害人畜，不會產生殘余物污染環境，不會引起昆蟲產生抗性。但桿狀病毒殺蟲劑具有殺蟲譜太窄、殺蟲速度緩慢等缺點，因此其應用受到限制。深入了解病毒基因的結構和功能，進一步研究其致病機理，為遺傳改良桿狀病毒殺蟲劑以擴大其殺蟲譜和提高其殺蟲效率提供了重要的理論指導。

SpltMNPV屬桿狀病毒科核多角體病毒屬，基因組全長139 342 bp，含有141個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）[12]。到目前為止，在所有已測序的桿狀病毒基因組中發現38個核心基因[13-16]，SpltMNPV ORF75（Splt75）是桿狀病毒核心基因之一，其在苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）中的同源基因ORF78（Ac78）在桿狀病毒的生活周期中具有重要作用[17]，但其作用機理未知。蛋白結構與功能息息相關，本研究選取到目前為止尚未見研究報道的Splt75作為研究對象，利用生物信息學方法系統分析Splt75基因及其編碼蛋白Splt75的結構，為進一步揭示Splt75的功能和作用機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

SpltMNPV G2毒株，由中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室贈送提供，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α為本實驗室保存。

pMD18-T Vector、Taq酶，購自TaKaRa公司；氨芐青霉素，購自Sigma公司；限制性內切酶，購自New England BioLabs公司；PCR產物純化試劑盒、常規質粒提取試劑盒，購自Omega公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 SpltMNPV基因組DNA的提取

參照文獻[18]的方法，從SpltMNPV多角體中提取病毒基因組DNA。

1.3 PCR擴增及克隆

根據Genbank登錄的SpltMNPV G2株基因組全序列[12]（AF325155）中的Splt75基因全長序列，設計一對引物擴增Splt75基因，由廣州擎科生物技術有限公司合成。上游引物PF：5'-GAGCTCATGAATTT GGACGTACCCTACGA-3'，下游引物 PR：5'-GGATC CCTAAATGTACAAAGAGTCGGGAC-3'，下劃線部分分別為引入的SacI和BamHI酶切位點。以所提取的SpltMNPV基因組DNA為模板進行PCR擴增，回收PCR擴增產物，克隆入pMD18-T Vector，轉化感受態DH5α，挑取并過夜培養陽性克隆，提取質粒，酶切鑒定，并在廣州擎科生物技術有限公司進行測序，比較測序結果與Splt75基因序列。

1.4 生物信息學分析

使用DNASTAR軟件推導出測序得到的Splt75基因序列編碼蛋白Splt75的氨基酸序列，應用在線工具ExPASy ProParam（https://web.expasy.org/protparam）分析Splt75蛋白的分子式、氨基酸組成和相對分子量等理化性質。蛋白質的親疏水特性預測使用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale），蛋 白 質信號肽的檢測使用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP），蛋白質結構域與模式的預測使用 TMHMM Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）、MotifScan（https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan） 和 Psort（http://www.genscript.com/psort.html）等在線軟件。利用NCBI Conserved Domain Search搜索工具搜索Splt75的保守區域。蛋白質二級結構利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線軟件進行分析，蛋白質三級結構的預測利用SWISS-MODEL在線工具（https://www.swissmodel.expasy.org）。

2 結果與分析

2.1 Splt75基因的克隆

以所提取的SpltMNPV基因組DNA為模板，從SpltMNPV基因組中PCR擴增出一條特異的363 bp左右的片段，克隆入pMD18-T載體，轉化感受態DH5α，培養陽性克隆，提取質粒，用SacI和BamHI進行雙酶切鑒定，獲得與預期相符的363 bp的目的片段和2 692 bp的載體片段（圖1），質粒命名為T-Splt75。T-Splt75的測序結果顯示，pMD18-T載體中的插入片段與Genbank登錄的SpltMNPV G2株基因組全序列（AF325155）中的Splt75基因全長序列完全一致，沒有發生堿基突變。

圖1 重組質粒T-Splt75的鑒定

2.2 Splt75蛋白的理化性質分析

通過DNASTAR軟件和在線軟件ExPASy ProParam （https://web.expasy.org/protparam） 分 析Splt75基因編碼蛋白Splt75的理化性質。Splt75蛋白由120個氨基酸組成（圖2），其中纈氨酸（Val）13個、亮氨酸（Leu）12個，含量相對較高，分別為10.8%和10.0%；共11個帶負電荷氨基酸（Asp、Glu），占9.2%；12個帶正電荷氨基酸（Arg、Lys），占10.0%；預測相對分子質量為13 137.16 Da，蛋白等電點為7.86，分子式為C583H942N160O174S5。Splt75蛋白的半衰期為30 h；不穩定指數為37.4（小于40），是穩定蛋白。

2.3 Splt75蛋白的疏水性分析

運用 ProtScale（https://web.expasy.org/protscale）在線軟件分析Splt75蛋白的親疏水性，結果如圖3所示。Splt75蛋白第103位的精氨基（Arg）分值最低，為-3.189，第83位的亮氨酸（Leu）和84位的半胱氨酸（Cys）的分值最高，為3.989，在74～97氨基酸區域存在疏水區域，Splt75蛋白總體表現為疏水。

圖2 Splt75的氨基酸組成

圖3 Splt75的親疏水性分析

2.4 Splt75的跨膜結構和信號肽預測

使用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預測Splt75蛋白的跨膜結構區，結果如圖4所示。在Splt75蛋白的76～98氨基酸區域存在跨膜結構區。利 用 SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線預測顯示Splt75蛋白無信號肽，Psort（http://www.genscript.com/psort.html）在線預測顯示Splt75蛋白C末端無KDEL內質網滯留信號模序、內質網膜滯留信號模序和內質網回運信號類似模序（Endoplasmic Reticulum Retrieval Signals） （KKXX-like motif）。

圖4 Splt75的跨膜結構區分析

2.5 Splt75的蛋白序列模式預測

運用Motif Scan（https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）對Splt75蛋白進行分析，結果如表1所示。Splt75蛋白中可能含有1個N-糖基化位點（59～62），1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（30～33），1個蛋白激酶C磷酸化位點（32～34），1個N-豆蔻酰化位點（35～40），1個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點（104～107），1個酰胺化位點（100～103）。

利用NCBI Conserved Domain Search搜索工具發現Splt75屬于ORF78（Ac78）超家族成員（圖5），該家族成員由AcMNPV ORF78及其同源的桿狀病毒蛋白組成。

表1 Splt75蛋白序列模式分析結果

圖5 Splt75的保守區域預測

2.6 Splt75的二級結構

運用在線軟件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）分析Splt75蛋白的二級結構，結果如圖6所示。Splt75二級結構的主要構成元件是α螺旋和無規則卷曲。其中α螺旋由48個氨基酸構成，占總氨基酸的40.00%，無規則卷曲由52個氨基酸構成，占總氨基酸的43.33%，18個氨基酸參與形成延伸鏈，占比15.00%，β轉角由2個氨基酸構成，占比1.67%。

圖6 Splt75二級結構預測

2.7 Splt75的三級結構

運用SWISS-MODEL在線工具（https://www.swissmodel.expasy.org）構建Splt75蛋白的三級結構模型，結果如圖7所示。GMQE評分為0.16（質量評估的數字越大，結果越可靠），QMEAN評分為-2.25（基于不同幾何特性的符合評估，分數≤-0.4表示一致性較差，模型可靠度較差）。

圖7 Splt75三級結構預測

SpltMNPV的Splt75是桿狀病毒核心基因，NCBI Conserved Domain Search搜索工具發現，Splt75屬于ORF78（Ac78）超級家族成員，與Ac78的序列一致性為32%，表明Splt75可能具有與Ac78相似的功能。前期對Ac78的研究發現，Ac78蛋白是桿狀病毒的一個多功能蛋白，主要參與BV的產生、多粒包埋ODV （multiple nucleocapsid-enveloped ODV，M-ODV）的形成和病毒在粉紋夜蛾幼蟲體內起始初始感染的過程。Ac78的缺失導致BV和M-ODV的產量顯著下降以及病毒在粉紋夜蛾幼蟲體內起始初始感染能力的喪失，Ac78的氨基酸2～25和64～88區域在其所有旁系同源物（ortholog）中高度保守，是Ac78的關鍵區域[17]。

生物信息學是預測蛋白質功能以及分析蛋白質結構與功能之間關系的重要方法，在醫學、生物技術等多個領域應用廣泛[19]。通過生物信息學分析，Splt75蛋白由120個氨基酸組成，相對分子質量為13 137.16 Da，蛋白等電點為7.86，性質穩定，總體表現為疏水。Splt75蛋白無信號肽，存在跨膜結構區，無KDEL內質網滯留信號模序、內質網膜滯留信號模序和內質網回運信號類似模序（KKXX-like motif）。前期研究中通過生物信息學分析發現，在Ac78的C末端存在一個可能的內質網回運信號類似模序（KKXX-like motif），通過構建缺失Ac78 KKXX-like模序的重組病毒vAc78:del105-108研究發現，該模序在Ac78功能和在感染細胞中定位非必需[20]，這與該模序在Ac78的同源蛋白中并不保守相一致。

蛋白質的翻譯后修飾對調節蛋白質的活力與功能具有非常重要的作用[21]。通過對Splt75的蛋白序列模式預測發現，Splt75有N-糖基化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、蛋白激酶C磷酸、N-豆蔻酰化、cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化和酰胺化等多個翻譯后修飾位點。在Ac78中，經預測可能存在2個N-糖基化和1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化翻譯后修飾位點（文中未顯示），表明N-糖基化位點和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點在Splt75及其同源蛋白中相對保守，可能在Splt75及其同源蛋白的功能中具有重要作用。對Splt75的二級結構預測發現，α螺旋和無規則卷曲為Splt75的主要結構。α螺旋的存在有利Splt75蛋白結構的穩定，α螺旋占比40.00%，說明Splt75可能相對保守，這與Splt75是桿狀病毒核心基因相符。無規則卷曲結構的存在區域可能是Splt75發揮功能的重要區域，無規則卷曲占比43.33%，說明Splt75可能在桿狀病毒生活周期中具有重要作用。

3 結論

Splt75基因編碼120個氨基酸，編碼蛋白Splt75分子量為13 137.16 Da，蛋白理論等電點為7.86，分子式為C583H942N160O174S5，是穩定的疏水蛋白；Splt75蛋白中無信號肽，存在跨膜結構區，C末端無KDEL內質網滯留信號模序、內質網膜滯留信號模序和內質網回運信號類似模序；可能含有1個N-糖基化位點、1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、1個蛋白激酶C磷酸化位點、1個N-豆蔻酰化位點、1個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點以及1個酰胺化位點；屬于ORF78（Ac78）超家族成員；Splt75的二級結構以α螺旋和無規則卷曲為主要構成元件。本研究結果可靠，為進一步研究Splt75在桿狀病毒生活周期中的功能和作用機理提供了理論基礎。