油氣微生物數量變化特征模擬實驗

楊 帆，許科偉，顧 磊，寧麗榮，盧 麗，沈忠民

（1.中國石化石油勘探開發研究院無錫石油地質研究所, 江蘇無錫 214151；2.中國石化油氣成藏重點實驗室, 江蘇無錫 214151；3.成都理工大學油氣藏地質及開發工程國家重點實驗室, 四川成都 610059）

油氣微生物勘探是通過檢測地表土壤中以輕烴為碳源的微生物數量異常信息來預測下伏油氣藏分布的一種方法[1-7]。現今油氣微生物勘探及開發領域所涉及的檢測技術已趨于成熟，主要有培養法和分子生物學方法[8-12]。但目前微生物勘探機理問題仍亟待研究，主要表現為:一是國內外開展的油氣微生物勘探均以野外采集的土壤樣品為對象，對實際油氣藏分布信息還存在一定局限性和不確定性，以氣為主和以油為主的概念模型有待建立；二是油氣藏滲漏區上方地表土壤中的微生物數量變化機制尚不明確。因此，通過構建確定性油氣背景信息的人工模擬模型，研究不同模擬條件下油氣微生物數量的變化特征，為微生物勘探理論提供明確的實驗依據。

1 人工模擬實驗裝置構建

模擬實驗裝置的設計以微生物勘探基本原理為依據，即油氣藏中輕烴組分為微生物生長供給能量，地表土壤中能夠降解這類輕烴的特定微生物。人工模擬實驗裝置需要考慮樣品介質、烴源體積分數、密封性等各要素。本文在國內外相關資料調研的基礎上[13-14]，設計并構建一種用于油氣微生物數量變化機制研究的人工模擬模型。

1.1 裝置設計

模擬裝置為自行設計的培養瓶，培養瓶體積為2.77 L，儲氣室體積為2.30 L，瓶身為耐高溫高壓的玻璃材質，內部設有隔網，隔網上可放置模擬實驗用的土壤樣品（約200 g）。培養瓶密封蓋可拆卸，內置丁基橡膠墊，密封性良好。培養瓶具體設計特征見專利“用于油氣微生物研究的模擬裝置（專利號:ZL201610172866X）”。模擬實驗所用的土壤樣品取自江蘇油田某油氣區，分別在油氣區和背景區的地表鉆孔取樣，取樣深度約60 cm，該深度地表干擾因素較小，保證了土壤樣品中微生物的活性[15-18]。樣品主要為亞砂土和亞黏土，含水率30%～35%。

1.2 構建不同的培養環境

設置多組培養瓶，將過篩后均一化的土壤樣品放置于培養瓶中隔網上，密封瓶蓋，充入純度為99%的輕烴氣體，構建油氣藏微滲漏模擬環境和輕烴不同滲漏量模擬環境。在模擬實驗中，培養瓶中的氣體會被微生物降解而逐漸減少，需定期向培養瓶中補充輕烴氣體和空氣。模擬實驗處于常溫下，與地表土壤環境溫度相符。在不同培養時間點采集瓶中樣品，然后對樣品中的油氣微生物進行檢測。

1.3 模擬培養可信度分析

設置兩組培養瓶，一組培養瓶中放置一定量的土壤樣品，另一組作為空白對照。密封后向培養瓶中充入輕烴氣體，動態監測輕烴體積分數變化，以此來考察微生物能否降解培養瓶中的輕烴氣體。

經過18 d 動態監測，未放置土壤樣品的培養瓶內輕烴體積分數基本穩定（圖1a），培養過程中多次檢測并不影響輕烴體積分數，表明實驗操作不會導致輕烴體積分數出現統計差異；放置土壤樣品的培養瓶中輕烴氣體體積分數逐漸下降（圖1b），表明輕烴氣體刺激了土壤中油氣微生物生長，同時自身也被油氣微生物降解，也證明了培養模型已基本建立。

圖1 培養瓶中輕烴體積分數變化曲線

2 油氣微生物數量變化特征

2.1 氣藏和油藏微滲漏模擬環境

取兩組培養瓶，分別充入甲烷和丁烷，體積分數為10-4，代表理想化的氣藏和油藏微滲漏條件。模擬實驗周期為30 個月，每隔3 個月采集一次樣品，利用平板菌落計數法獲取土壤樣品中甲烷氧化菌和丁烷氧化菌的數量，實驗結果如下:在模擬氣藏條件下（甲烷氣體馴化），甲烷氧化菌（MOB）數量增幅較快，前3 個月為快速增長期，18 個月左右趨于穩定。由于微生物的生長、繁殖和消亡同時存在，微生物不斷與周圍環境進行物質交換，其代謝活動由快變慢，最終數量達到平衡狀態。丁烷氧化菌數量在甲烷馴化條件下也有所增長，表明丁烷氧化菌群中某些兼性菌逐漸適應了氣藏模擬環境，也能夠降解甲烷，因此在數量上呈現增加趨勢。在模擬油藏環境下，丁烷氧化菌（BOB）數量變化特征類似于模擬氣藏條件下的甲烷氧化菌。空白對照實驗中，兩種微生物的數量在30 個月內緩慢下降，表明微生物在無烴供給條件下逐步消亡（圖2）。實驗表明，在模擬輕烴微滲漏環境下，甲烷氧化菌、丁烷氧化菌及各自的兼性菌對氣態烴底物均有較好的響應，能將輕烴氣體用于自身繁殖。在油氣勘探中，這兩種微生物指標均對下伏油氣藏的分布具有指示意義。國內外的微生物勘探應用實例表明，實際油氣藏上方地表中油氣微生物數量明顯高于背景區，與模擬實驗中供烴和無烴條件下微生物數量特征一致。

圖2 氣藏和油藏模擬環境下油氣微生物數量變化特征

2.2 輕烴不同滲漏通量模擬環境

油氣藏中的輕烴組分滲漏至地表的通量因地質條件的不同而存在差異。烴類垂向微滲漏理論認為，輕烴滲漏量小于10-4為微滲漏，大于10-2為宏滲漏。模擬實驗建立不同輕烴體積分數環境，研究不同輕烴滲漏通量條件下微生物數量變化規律。實驗設置甲烷充氣組和丁烷充氣組，烴類體積分數梯度分別為10-5、10-4、10-3、10-2、10-1。實驗統計了不同滲漏通量條件下微生物數量變化特征（表1、表2）。

表1 不同甲烷體積分數培養條件下MOB 數量統計

表2 不同丁烷體積分數培養條件下BOB 數量統計

初始樣品中甲烷氧化菌數量相同，經過3個月的培養，甲烷氧化菌的數量均有增加。在甲烷體積分數為10-5和10-4時，甲烷氧化菌數量增長較少，分別為1.18×105，1.15×105cfu/g，在體積分數為10-2時，其數量增長到1.42×105cfu/g，但體積分數為10-1時，甲烷氧化菌的數量增幅反而減少，這是由于高體積分數輕烴會對微生物生長造成抑制或毒性。整體來看，短期培養時間內油氣微生物數量與輕烴氣體體積分數基本呈正相關關系。培養時間延長至30個月時，所測得的不同輕烴體積分數下的微生物數量趨于一致，說明實際地質環境下，輕烴擴散至地表的體積分數因油藏壓力、埋深、油氣性質和地層構造而不同，但最終均會引起地表微生物異常。丁烷氧化菌數量變化特征與甲烷氧化菌數量變化特征相似。

3 油氣指示基因豐度變化特征

在油氣微生物勘探領域，甲烷氧化菌的功能基因甲烷單加氧酶基因（pmoA）特異性最高，被廣泛運用于環境樣品中甲烷氧化菌的定量[19-20]。國內學者張凡等利用甲烷氧化菌功能基因（pmoA）研究了大港油田天然氣庫上方土壤樣品中的甲烷氧化菌數量，結果表明氣田上方的pmoA基因拷貝數明顯高于背景區，證明了分子勘探的有效性[21-22]。丁烷單加氧酶基因（bmoX）負責降解C4-C9烴類[23]。目前這兩種油氣指示功能基因在國內外用于診斷氣藏和油藏的分布。本次研究采用實時定量PCR技術考察模擬實驗中油氣指示基因豐度變化特征。

圖3 不同模擬環境下油氣指示基因豐度變化曲線

如圖3所示，在模擬氣藏條件下，氣指示基因pmoA豐度從實驗開始至18個月呈快速增長趨勢，21個月至30個月達到平臺期，油指示基因bmoX豐度呈下降趨勢，有異于丁烷氧化菌平板計數呈現增長的現象，這是由于培養法檢測含有兼性菌，而油氣指示基因相對保守，嚴格遵循自身的代謝途徑，因此在甲烷培養條件下，bmoX基因豐度不會增加。在模擬油藏條件下，bmoX基因豐度增幅較快，pmoA基因豐度呈下降趨勢。實驗表明，在不同輕烴組分培養條件的微滲漏環境下，pmoA基因和bmoX基因分別對甲烷底物和丁烷底物有良好的響應。在實際勘探中油氣指示基因指標不受其他碳氫化合物的干擾，特異性較強。

4 油氣藏枯竭模擬環境

油氣藏經過常年開采后，地層壓力下降，產量降低而逐漸枯竭，油氣藏中的輕烴滲漏至地表的動力和通量也隨之減弱，但地表土壤中油氣微生物是否會隨油氣藏的枯竭而發生變化，本研究通過模擬實驗對該問題進行探討。

前期充氣模擬實驗結束后，排空模擬裝置中的氣體并停止輕烴補給。每隔兩個月取一次樣，檢測油氣微生物的變化特征（實驗僅對甲烷氧化菌和pmoA基因進行檢測）。結果表明，在無烴供給條件下，甲烷氧化菌的數量及pmoA基因豐度均呈現緩慢回落趨勢。甲烷氧化菌數量在前4個月保持穩定，然后開始線性減少，12個月以后基本接近初始數量（圖4），這是因為微生物如果缺少碳源供給，其生長代謝會迅速降低或停止，導致機體衰亡。pmoA基因豐度則在前10個月內保持穩定，然后緩慢下降并保持0.36×105copies/g左右，這是由于微生物DNA不會在短期內分解，所以基因豐度沒有回落到初始值。在實際地質條件下，地表土壤中的油氣微生物在輕烴微滲漏環境下經歷長期緩慢的馴化過程，油氣藏中的輕烴只要能夠持續滲漏至地表，土壤中油氣微生物的數量就會維持動態平衡。油氣藏枯竭模擬環境下微生物消亡的規律具有剩余油追蹤、油田老區塊評價的應用價值。

圖4 無烴供給下微生物數量變化（輕烴體積分數為10-4）

5 認識與結論

（1）在模擬油氣藏滲漏環境下，微生物利用輕烴氣體生長發育，其數量逐漸增加并在18 個月達到穩定。甲烷氧化菌和丁烷氧化菌中的某些兼性菌在馴化條件下能夠分別適應丁烷和甲烷的培養環境，在實際勘探中兩種油氣微生物指標均對油氣藏具有指示意義。

（2）在短期培養時間內，油氣微生物數量的增長和輕烴體積分數成正比。高體積分數輕烴對微生物生長產生一定抑制作用。長期培養條件下，不論是輕烴微滲漏還是宏滲漏，油氣微生物數量均趨于一致。

（3）氣指示基因pmoA 和油指示基因bmoX 分別對甲烷和丁烷都有良好的響應，豐度呈現增長趨勢，兩者特異性較強，嚴格遵循自身代謝途徑，不受其他輕烴的干擾，在實際勘探中油氣指示基因指標的特異性更高。

（4）油氣藏枯竭的模擬環境下，油氣微生物從生命特征上出現消亡，數量呈現線性下降趨勢。這一規律可應用于實際油氣藏開發中，通過檢測地表油氣微生物分布和變化情況，對剩余油追蹤和老區塊評價具有一定的參考價值。