木鱉子炮制前后亞油酸和油酸的相對含量及指紋圖譜比較研究

姚夢雪 ，汪小莉 ，潘凌宇 ，張姍姍 ，韓燕全

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230031； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230031）

木鱉子是葫蘆科植物木鱉Momordica cochinchinensis（Lour.）Spreng.的干燥成熟種子，味苦、微甘，性涼；有毒，歸肝、脾、胃經(jīng)［1］。木鱉子作為中藥使用，始載于《開寶本草》［2］，其具有散結(jié)消腫、攻毒療瘡的功效，臨床常用于治療瘡瘍腫毒、瘰疬、痔瘺、干癬、禿瘡等，療效確定［3］。木鱉子屬于種子類中藥，含油量豐富，具有一定刺激性與毒性，需要除油制霜后入藥［4-5］。目前研究表明，木鱉子油中含有亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸，該類成分具有降低心血管疾病的發(fā)病率、防癌等活性［6-7］。本研究在課題組前期對木鱉子中皂苷類成分的含量及指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上［8］，以脂肪油中亞油酸和油酸含量為主要考察指標(biāo)，采用UPLC 法比較木鱉子炮制前后的兩種脂肪油類成分含量和UPLC 指紋圖譜變化，以期了解炮制對脂肪油類成分的影響，并為木鱉子炮制“減毒增效”及其進(jìn)一步研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

超高效液相色譜儀（美國Waters Acquity HClass，UPLC）；ME55 型十萬分之一分析天平［梅特勒-托利（上海）有限公司］；KQ3200DB 型超聲儀（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；KDC-16H 高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試 藥

亞油酸對照品（批號：DST180719-159）、油酸對照品（批號：DST170417-063）均購于成都德思特生物技術(shù)有限公司。10 批不同產(chǎn)地的木鱉子藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李立華主任中藥師鑒定，均符合2015 版《中國藥典》木鱉子“鑒別”項(xiàng)下規(guī)定。甲醇、乙腈（Sigma 公司）均為色譜純；蒸餾水（屈臣氏公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 木鱉子生品、木鱉子霜亞油酸和油酸相對含量測定

2.1.1 木鱉子霜制備 根據(jù)2015 版《中國藥典》木鱉子項(xiàng)下炮制工藝，結(jié)合課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，制備木鱉子霜。主要方法為：取一定量去除外殼的木鱉子種仁，置于真空干燥箱內(nèi)，在80 ℃條件下加熱一定時(shí)間后取出晾涼，適度粉碎后用草紙包裹放置于榨油機(jī)內(nèi)，壓制至草紙上不再出現(xiàn)油漬為止，即得木鱉子霜。

2.1.2 色譜條件 Luna Omega Polar C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；柱溫為 30 ℃；檢測波長為203 nm；流速為0.25 mL/min。流動相A 為乙腈，B 為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫程序如下：0~3 min，3%~15%A；3~13 min，15%~45%A；13~20 min，40%~100%A；20~22 min，100%A；22~23 min，100%~3%A；23~25 min，3%A。

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱取亞油酸、油酸對照品適量，配制成一定濃度的對照品母液；再取一定量對照品母液，加甲醇配制成亞油酸濃度為0.157 mg/mL，油酸濃度為0.025 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.4 供試品溶液制備 分別取10 批不同產(chǎn)地的木鱉子生品與木鱉子霜，粉碎，過60 目篩，精密稱定3 g 木鱉子生品與木鱉子霜，置于索氏提取器中，于提取瓶中加入60%乙醇100 mL，在85 ℃條件下水浴回流提取4 h。將提取后的樣品倒入已稱重的蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋中85 ℃條件下水浴蒸干溶劑，取出放涼。將所得殘?jiān)浦?0 mL的容量瓶內(nèi)，加甲醇至刻度。重復(fù)制備過程，共得10 批不同產(chǎn)地木鱉子生品和木鱉子霜樣品溶液。取樣品溶液1.5 mL，于12 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，上清液過0.2 μm 濾膜供UPLC分析用。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.3 項(xiàng)”下的混合對照品溶液于容量瓶中，加甲醇配制成不同系列濃度的溶液，依次進(jìn)樣，并按“2.1.2 項(xiàng)”下的色譜條件對峰面積進(jìn)行測定，并以亞油酸、油酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，其中亞油酸回歸方程為Y=114 211X-45 222（r=0.9997），在 0.157~0.942 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；油酸回歸方程為 Y=37 940X-18 993（r=0.9997），在0.025~0.150 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。表明其線性范圍良好。

2.1.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液2 μL，按“2.1.2 項(xiàng)”下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣 6 次，測定亞油酸、油酸峰面積，計(jì)算精密度。結(jié)果顯示RSD值在0.65%～0.97%之間，表明儀器精密度良好。

2.1.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取S16 號樣品6份，按照“2.1.4 項(xiàng)”下方法處理，在“2.1.2 項(xiàng)”條件分別于 0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h 定時(shí)進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算RSD 值，結(jié)果顯示RSD 值在1.59%～2.14%之間，表明至少在24 h 內(nèi)，樣品溶液穩(wěn)定。

2.1.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取S19 號樣品6份，按照“2.1.4 項(xiàng)”下方法處理，在“2.1.2 項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)樣，對供試品中亞油酸、油酸兩種成分的峰面積進(jìn)行記錄，計(jì)算兩種指標(biāo)成分含量，計(jì)算得其RSD 值在0.67%~0.83%之間，表明供試品重復(fù)性良好。

2.1.5.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取S12 號樣品，加入與樣品中成分含量接近的對照品溶液，按照“2.1.4項(xiàng)”下方法制備加樣回收樣品溶液6 份，按“2.1.2項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算各成分的加樣回收率［回收率（%）=（測得量-樣品含量）/加入量×100%］。結(jié)果亞油酸加樣回收率為107.68%，平均RSD 為0.87%；油酸加樣回收率為104.04%，平均RSD 為1.41%。表明木鱉子中兩種成分回收率良好。

2.1.5.6 含量測定 取木鱉子生品和木鱉子霜各10 批樣品的供試品溶液，按照“2.1.2 項(xiàng)”下條件進(jìn)樣，如圖1 所示，兩種指標(biāo)成分與其他成分分離度較好，按外標(biāo)法計(jì)算亞油酸、油酸的含量，結(jié)果見表 1、表 2。

圖1 亞油酸、油酸混合對照品與樣品UPLC圖譜

表1 木鱉子中亞油酸、油酸含量測定結(jié)果 （n=10）

表2 木鱉子炮制前后指標(biāo)成分平均含量比較（n=10，x±s）

由表1、表2 可以看出，木鱉子制霜后，其中亞油酸和油酸的相對含量均有所增加，亞油酸和油酸相對含量增加率分別為6.97%和15.85%。

2.2 木鱉子生品、木鱉子霜UPLC 指紋圖譜

2.2.1 樣品制備、對照品溶液制備、供試品溶液制備 制備方法同2.1.1、2.1.3、2.1.4 項(xiàng)。

2.2.2 方法學(xué)考察

2.2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取S12 號樣品6份，按照“2.1.4 項(xiàng)”下方法制備6 份木鱉子供試品溶液，在“2.1.2 項(xiàng)”下方法自動進(jìn)樣器連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其圖譜；結(jié)果表明，測得的色譜指紋圖譜與其共有模式圖譜的相似均大于0.999（中位數(shù)），22 個色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD值分別在0.003%~0.117%和0.531%~4.687%之間，表明儀器精密度良好。

2.2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取S16 號樣品6份，按照“2.1.4 項(xiàng)”下方法制備6 份木鱉子供試品溶液，在“2.1.2 項(xiàng)”下方法進(jìn)樣測定，時(shí)間間隔為0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h。結(jié)果顯示在同一臺儀器測得的色譜指紋圖譜與其共有模式圖譜的相似度大于0.999（中位數(shù)），22 個色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD 值分別在0.046%~0.195%和1.587%~5.177%之間，表明在24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取S19 號樣品6份，按照“2.1.4 項(xiàng)”下方法制備6 份木鱉子供試品溶液，按“2.1.2 項(xiàng)”下色譜條件，分別進(jìn)樣，將采集的指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件2012（A 版）”，考察各份樣品色譜峰保留時(shí)間的一致性，計(jì)算其相似度，結(jié)果表明6 份樣品的相似度均大于0.999（中位數(shù)），22 個色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD 值分別在0.006%~0.094%和0.675%~4.828%之間，表明樣品的重復(fù)性較好。

2.2.3 木鱉子指紋圖譜中的共有峰確定 取20批木鱉子供試品溶液，按“2.1.2 項(xiàng)”下方法依次進(jìn)樣檢測，根據(jù)指紋圖譜的檢測結(jié)果，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件2004（A 版）”，生成木鱉子共有模式的對照指紋圖譜，共確定了22 個共有色譜峰，通過與對照品比對，確認(rèn)了2 個色譜峰，分別為亞油酸（19）、油酸（20），共有模式色譜圖結(jié)果見圖2，22 個色譜峰的保留時(shí)間和相對峰面積見表3、表4。

由表3 和表4 結(jié)果可見，木鱉子炮制前后的相對峰面積分別在0.538~11.294、0.360~6.077 之間，RSD 變化分別在 33.79%~122.21%、0.28%~61.97%之間，木鱉子炮制前后脂肪油成分總體變化明顯。

圖2 木鱉子共有峰UPLC 對照圖譜

2.2.4 木鱉子指紋圖譜共有模式的建立 取20批木鱉子供試品溶液，按“2.1.2 項(xiàng)”下方法對其指紋圖譜進(jìn)行檢測，并利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件2004（A 版）”，得到指紋圖譜疊加圖（圖3）及指紋圖譜相似度評價(jià)表（表5）。

表3 10 批木鱉子生品指紋圖譜相對峰面積

圖3 木鱉子生品與木鱉子霜UPLC 指紋圖譜

表5 木鱉子UPLC 指紋圖譜相似度

由表5 結(jié)果可以看出，木鱉子生品與木鱉子霜的脂肪油成分相似度較好，其值均大于0.996。

2.3 樣品的聚類分析

為更直觀比較其炮制前后的差異，采用SIMCA 13.0.3 軟件，對10 批木鱉子生品，10 批木鱉子霜樣品進(jìn)行聚類分析。其中S（1~10）為木鱉子生品，P（1~10）為木鱉子霜，結(jié)果見圖4。通過聚類分析結(jié)果樹狀圖可明顯看出，20 批木鱉子樣品分為兩類，其中S1~S10 聚為一類，P1~P10 聚為一類，即木鱉子生品為一類，木鱉子霜為一類。

圖4 20 批木鱉子樣品聚類分析結(jié)果樹狀圖

2.4 樣品的主成分分析

運(yùn)用SIMCA 13.0.3 軟件對20 批木鱉子樣品進(jìn)行主成分分析，分析結(jié)果見圖5，其中S（1~10）為 10 批不同產(chǎn)地木鱉子生品，P（1~10）為 10 批不同產(chǎn)地木鱉子霜，圖中每個點(diǎn)代表一個木鱉子樣品。由主成分分析圖可清晰地看出，S（1~10）距離相近，P（1~10）距離相近，20 批樣品分布在中軸線兩端，互不交叉。結(jié)合聚類分析結(jié)果，可說明木鱉子生品與木鱉子霜在整體上存在一定差異。

圖5 20 批木鱉子主成分分析圖

3 討 論

本研究根據(jù)課題組前期工作及查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)對樣品進(jìn)行了全波長掃描，最終顯示203 nm波長下的圖譜信息量較多，各色譜峰的峰形良好，基線平穩(wěn)。同時(shí)，本研究考察了不同色譜柱對色譜峰形的影響，結(jié)果顯示樣品在Luna Omega Polar C1（82.1 mm×100 mm，1.6 μm）色譜柱條件下峰形良好。此外，本研究還考察了不同流動相系統(tǒng)的梯度洗脫條件、柱溫條件等對實(shí)驗(yàn)的分離度等影響，經(jīng)過優(yōu)化，最終選擇乙腈-0.1 %磷酸作為流動相，柱溫30 ℃，色譜柱為Luna Omega Polar C1（82.1 mm×100 mm，1.6 μm）作為本研究的色譜條件。在此色譜條件下各色譜峰的峰形及分離度較好，且基線平穩(wěn)，得到了含量測定和指紋圖譜分析的較佳條件。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析上不僅以常用的相似度比較，還結(jié)合聚類分析和主成分分析等手段，更進(jìn)一步說明了炮制前后樣品脂肪油部位的質(zhì)量差異。

臨床上，木鱉子多用于腫瘤患者輔助治療，其單味藥和復(fù)方制劑均具有一定療效。研究表明，木鱉子所含脂肪油對人體具有調(diào)節(jié)平衡的作用，在降血脂、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)方面起到重要作用，其中亞油酸和油酸為脂肪油中已知的主要成分，且具有抗炎、降低心腦血管疾病及抗腫瘤等作用［9-10］。但是，其脂肪油類成分又具有一定的刺激性和毒性，因此需要炮制去油制霜以達(dá)到“減毒增效”的目的。目前還未見有炮制對亞油酸和油酸含量及脂肪油的指紋圖譜影響的研究報(bào)道。因此，本研究選擇木鱉子脂肪油部位為研究對象，對其炮制前后亞油酸和油酸的含量變化及指紋圖譜進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，木鱉子制霜后其亞油酸和油酸相對含量升高，脂肪油部位的指紋圖譜色譜峰變化明顯，為其炮制前后質(zhì)量變化提供了部分依據(jù)。由于目前可獲得的脂肪油對照品較少，本研究只鑒定了亞油酸和油酸2 個成分，而炮制前后脂肪油類成分的歸屬及脂肪油對藥效、毒性的影響等還有待進(jìn)一步研究。