HPLC 測定山西不同產地野生款冬花中款冬酮的含量

劉計權，張志芳，王亞君，王艷鳳

（山西中醫藥大學，山西晉中030619）

●中醫藥學在世界上首先發現了中藥并首創了方劑，醫方是“除疾 保性命之術”，而劑則有“調百藥齊，和之所宜”之功。采用現代藥物制劑技術重新研究并升華古典方劑之術，開創未來藥物制劑技術和新劑型藥物研究的全新思維和方向。

款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，每年12 月或地凍前當花尚未出土時采挖，除去花梗及泥沙，陰干入藥［1］。款冬花具有潤肺下氣、止咳化痰等功效，臨床上用于新久咳嗽、喘咳痰多、勞嗽咳血等，在中成藥生產中，款冬花又是通宣理肺丸、百花定喘丸等幾十種中成藥的重要原料［2］。

款冬花入藥始載于秦漢時期的《神農本草經》，列為中品，它的藥用價值、歷史淵源歷代醫家多有論述，除我國藥用外，歐美和北美洲均有以款冬的花蕾、花、葉和根治療咳嗽、感冒的記載［3］。

款冬花適應性極強，廣布于我國南北各省區，其中道地產區為河北、山西、陜西以及甘肅［4-5］。款冬花所含成分包括黃酮類、萜類、酚類、生物堿類等［6-7］，款冬酮是 2015 版《中國藥典》規定的指標性成分。

2009 年2 月，國家中藥現代化科技產業（山西）基地建設規劃實施方案中將款冬花和連翹、苦參、黨參、黃芪、遠志、柴胡、山楂、酸棗仁列為山西重點發展的九大中藥材種植品種。2016 年6 月18日，“國家中藥標準化項目”正式在山西啟動，該項目將制定中藥材、中藥飲片、中成藥生產規范及標準，會上確定款冬花和連翹、苦參、黨參、黃芪、遠志、柴胡、山楂、酸棗仁為山西省承擔的“國家中藥標準化項目”中的九大中藥品種。

本研究采用HPLC 法，測定了山西不同產地野生款冬花中款冬酮的含量，以期為山西野生款冬花的質量評價提供參考依據。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

日立高效液相色譜儀（Pump 5110；Auto sample 5210；Column oven 5310；Diode array detector 5430）［日立高新技術（上海） 國際貿易有限公司］、EX125ZH 電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］、202A-1 電熱干燥箱（上海申光儀器儀表有限公司）、FW-200 高速萬能粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司）、DZKW-4 雙孔電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）、SCQ-140701P 超聲提取儀（上海聲彥超聲波儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物

款冬酮對照品（111884-201704）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，乙醇，蒸餾水等。

野生款冬花藥材采自山西境內13 個縣，經鑒定均為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾。款冬花藥材來源信息見表1。

表1 野生款冬花來源信息表

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相采用甲醇-水溶液（85∶15）等度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；檢測波長220 nm，進樣量10 μL。對照品溶液和供試品溶液HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 款冬HLPC 色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取款冬酮對照品5.2 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至10 mL。精密吸取上述溶液1.0 mL 移入10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容至10 mL，搖勻，制成濃度為52 μg/mL 的款冬酮對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取款冬花藥材，除去花梗、泥沙等非藥用部分，在50 ℃烘箱中烘干至恒重。將烘干的藥材粉碎后過4 號篩，取過篩后的款冬花藥材粉末約1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入乙醇50 mL，稱定重量，浸泡30 min，回流提取1 h，放冷，再稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取款冬酮對照品溶液 1、3、6、9、12 μL，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，款冬酮的回歸方程為y=2 631 856.73x-4617.38，r=0.9993。表明款冬酮在 0.52～6.24 μg 內線性關系良好。

2.5 精密度實驗

精密吸取款冬酮對照品溶液10 μL，連續進樣6 次，測定峰面積積分值，結果得RSD 為1.57%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性實驗

取同一批款冬花供試品溶液，按2.1 項下色譜條件，分別于 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 進行測定，記錄款冬酮峰面積，求得RSD 為0.98%。結果表明供試樣品溶液在10 h 內穩定性良好。

2.7 重復性實驗

精密稱取同一批款冬花藥材粉末6 份，每份約1.0 g，精密稱定，按2.3 項下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件，依次進樣10 μL 進行測定，測得款冬花藥材中款冬酮的平均含量為1.06 mg/g，RSD 為1.28%，表明該實驗方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的同一批款冬花藥材粉末6 份，每份約0.5 g，于每份藥材粉末中分別加入濃度為0.52 mg/mL 的款冬酮對照品溶液1 mL，分別按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件依次進行測定，計算款冬酮的平均加樣回收率為98.03%，RSD 為1.56%，表明該方法的回收率良好。結果見表2。

表2 加樣回收率實驗結果

2.9 樣品含量測定

將13 個產地的款冬花藥材按2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件，分別取樣10 μL 注入高效液相色譜儀，測得峰面積值，根據線性方程計算款冬酮的含量。結果見表3。

由表中測定結果可知，不同產地野生款冬花藥材中款冬酮的含量不同，其中以五寨縣款冬花藥材中款冬酮的含量最高（1.64 mg/g），夏縣款冬花藥材中款冬酮的含量最低（0.73 mg/g）。2015 版中國藥典中規定，款冬花藥材中款冬酮的含量不得少于0.70 mg/g［1］，山西野生款冬花藥材中款冬酮的含量均符合藥典規定的標準。

表3 樣品含量測定結果

3 討 論

在供試品溶液的制備中，提前浸泡30 min，料液比為1∶20，比較了回流提取1 h 與超聲提取（功率200 W，頻率40 kHz）1 h 對款冬酮含量的影響，以回流提取法制備的供試品溶液中款冬酮的含量較高。在回流提取中，考察了 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 不同料液比對款冬酮含量測定結果的影響，其中以料液比為1∶50 回流提取制備供試品溶液中款冬酮的含量最高。最終確定款冬花藥材供試品溶液的制備方法為料液比為1∶50、提前浸泡30 min、回流提取1 h。

中藥材有效成分的形成、轉化與積累，受到環境條件的深刻影響，其中環境條件的影響主要與經緯度、海拔高度、溫度、光照強度和土壤密切相關［8］。本研究在采集款冬花藥材的過程中發現，野生款冬花分布環境多樣，既有土層深厚、有機質豐富的林下、山腳下，也有土壤貧瘠的路邊、河灘、砂礫，不同生境在經緯度、海拔、土壤條件等方面存在一定的差異性，生境中共同的特點是土壤潮濕，所以土壤水分是影響其分布的重要因素。不同產地款冬花藥材中款冬酮含量的差異性是多種環境因子綜合作用的結果。