電針對MCAO 大鼠海馬中CACNα1D 的影響

羅 來 ，徐芳媛 ，許金森 ，潘曉華 ，黃倩茹 ，萬 隆

（1.福建中醫藥大學針灸學院，福建福州350108； 2.福建省中醫藥研究院，福建福州350003）

腦卒中是一種嚴重的神經系統疾病，也是世界第二大致死疾病，并且發病率呈逐年上升趨勢，對全世界人民都造成了巨大的負擔［1］。針灸治療腦卒中在我國歷史悠久，《針灸甲乙經》就有“偏枯，四肢不用，善驚，大巨主之”的記載，臨床療效也得到了廣泛的認可，并且針灸療法具有方法多樣、經濟簡便、不良反應少的優點，適合在臨床推廣。對于針灸治療腦卒中的機制目前眾說紛紜，其中對鈣離子通道的研究一直是一大熱點，鈣離子通道與心肌和血管平滑肌的功能正常與否有著重要的聯系。有研究表明大腦內存在鈣離子依賴性的神經遞質分泌，可能在腦缺血再灌注后超級化激活環核苷酸門控陽離子通道通過增加鈣離子內流，誘發神經元興奮毒性，從而參與缺血再灌注損傷的分子機制［2］。因此，本研究通過觀察電針對大腦中動脈閉塞模型（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠的腦卒中癥狀的影響和缺血側海馬CACNα1D mRNA 表達來探討電針治療腦卒中的機制，為電針治療腦卒中提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選用成年SD 雄性大鼠21 只，均由福建醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，體質量（300±20）g，每籠 7只大鼠，均自由進食及飲水，適應性飼養1 周。飼養條件：溫度（22±2）℃，濕度（55±15）%，12 h 明暗交替，自由進食與飲水。實驗過程中均嚴格按照國際動物保護及使用指南的規定進行。

1.1.2 試劑與儀器 華佗牌30 號0.5 寸不銹鋼毫針（中國上海）、SDZ-II 型華佗牌電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）、小動物呼吸麻醉系統（深圳瑞沃德生命科技公司，R407），L3800 號大鼠用MCAO 線栓（廣州佳靈生物技術有限公司）、NANODROP RNA 質量檢測儀（美國Thermo 公司）、海爾-80 ℃冰箱（中國山東）、ABI step one plus 熒光定量 PCR 儀（美國 Applied Biosystems 公司）、q-PCR 試劑盒 （北京 TRAN 公司）、Fast Quantity RT Kit 逆轉錄試劑盒（北京天根生化科技公司，KR106）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模 將18 只大鼠按隨機數字表法分為電針組、模型組、假手術組。電針組和模型組參照 Longa 改良線栓法［3］，在大鼠左側行MCAO手術，具體操作方法為：大鼠術前禁食不禁水12 h。將大鼠投入透明麻醉誘導盒中，體積為25 cm×12 cm×20 cm，開啟異氟烷流量并調至500 mL/min，濃度調至5%，持續1 min，待大鼠呼吸平穩緩慢，縮爪反射消失后，將大鼠取出戴上呼吸面罩，并將流量調為300 mL/min，濃度調為3%，并根據術中大鼠對手術刺激的反應，適當調節濃度、流量以維持麻醉深度。將麻醉后大鼠四肢固定仰臥于手術板上，備皮消毒，暴露左側頸部，取頸前正中切口，切開頸部皮膚，鈍性分離左側頸總動脈（Common carotid artery，CCA）、頸內動脈 （Internal carotid artery，ICA）、頸外動脈 （External carotid artery，ECA）。用縫合線在左側ECA 遠心端打一死結結扎ECA，動脈夾夾閉ICA、ECA，雙極電凝器電凝ECA 分支，在 ECA 距 CCA 分叉 1 cm 處剪開一個小口，將線栓緩慢沿ECA 插入ICA，在剪口處向下約2 mm 處使用縫合線打一活結略微綁緊ECA，之后剪斷ECA 并將殘端反折以使線栓插入ICA，遇到輕微阻力時即停止插入，進線深度為18~22 mm，再將ECA 殘端的活結打死防止線栓脫出。縫和傷口并消毒，2 h 后輕柔回抽線栓至CCA 分叉處，減去線栓的體外部分，實現再灌注損傷。假手術組只將頸部皮膚剪開，鈍性分離CCA、ICA、ECA 后即縫合，不予結扎和插線。保持室溫為25 ℃左右，直至大鼠蘇醒。

1.2.2 干預措施 電針組參考《實驗針灸學》［4］選取大鼠“神庭”“百會”穴，選用華佗牌30 號0.5 寸不銹鋼毫針向上斜刺0.2~0.3 cm，連接SDZ-II 電針儀，電流設置1.5~2.0 mA，以針體輕微抖動且大鼠耐受為度，選取疏密波，頻率2~5 Hz，每次20 min，術后24 h 開始進行干預，連續7 d。模型組和假手術組行同等條件抓取后回籠，不予治療。

1.3 標本采集與檢測

1.3.1 神經功能缺損評分 在手術后第1 天和第7 天對3 組大鼠進行神經功能缺損評分。大鼠蘇醒后，參照Zea-Longa 5 分法進行神經功能缺損評分，判斷造模情況［5］。0 分：沒有神經功能缺損；1分：未能完全伸展右側（患側）前爪，提示輕度神經功能缺損；2 分：行走時向右側轉圈，提示中度神經功能缺損；3 分：行走時向左側傾倒，提示重度神經功能缺損；4 分：不能自主行走，并且意識水平較低。選取1~3 分的大鼠，剔除0 分和4 分大鼠。

1.3.2 TTC 染色觀察腦梗死狀況 電針干預結束后將大鼠稱重麻醉斷頭取腦，將新鮮腦組織置于-20 ℃冰箱2 h 變堅硬后，放置于模具上進行切片，每個腦組織切6 片，每片厚度約0.2 cm，將腦組織切片放入2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC） 溶 液中，避光放入37 ℃溫箱30 min，每隔5 min 翻動1次，使每個面都能均勻染色。正常組織中的脫氫酶可將TTC 還原成紅色的三苯甲月替，故正常組織染色后呈紅色，而缺血組織中脫氫酶活性下降，染色后呈灰白色。

1.3.3 q-PCR檢測腦組織CACNα1DmRNA表達 實驗結束后，取出大鼠海馬，放入RNA 保存液中，-80 ℃冰箱備用。參照Trizol 一步法說明提取總RNA，具體步驟為：組織樣品在液氮中研磨至粉末，立即加入1 mL Trizol，充分混勻裂解。加入200 μL 氯仿，用力充分振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。取上清，加入等體積氯酚仿，充分振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min 離心 10 min。取上清，加入等體積氯仿，充分振蕩混勻，4 ℃12 000 r/min離心10 min。取上清，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，-20 ℃沉淀 1 h。4 ℃ 12 000 r/min 離心 15 min。棄上清，加0.5 mL 75%乙醇，4 ℃8000~10 000 r/min離心5 min。重復上一步驟。棄上清后短暫離心，移液槍吸干乙醇，真空干燥2 min。加20 μL RNAFree water，室溫溶解5 min，混勻后短暫離心得到RNA 溶液。使用Fast Quantity RT Kit 逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA，放入-80 ℃冰箱保存。引物序列見表1。q-PCR 反應體系：反應總體積10 μL，其中上下游引物各 0.3 μL，cDNA 2 μL，q-PCR master Mix 5 μL，ddH2O 2.4 μL。反應條件：95 ℃預變性90 s；95 ℃變性 5 s；60 ℃復性 15 s；72 ℃延伸20 s，共計40 個循環。每個標本均設復孔，重復3 次，獲得 CACNα1D mRNA 基 因 Ct 值 ，以GAPDH 為內參，按照 2-△△Ct方法處理數據。其中，△Ct=（目的基因平均 Ct-內參平均 Ct）；△△Ct=（待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct），所有數據均與內參比較。

表1 引物序列

1.4 統計學方法

數據以均值±標準差（x±s）表達，采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析，不符合正態分布使用秩和檢驗，符合正態分布采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD 檢驗，方差不齊使用Games Howen 檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 神經功能缺損評分

造模24 h 后，電針組和模型組神經功能缺損評分均高于假手術組（P＜0.05），電針組和模型組之間比較差異無統計學意義。術后7 d，電針組神經功能缺損評分低于模型組（P＜0.05），模型組神經功能缺損評分高于假手術組（P＜0.05），但電針組和假手術組比較差異無統計學意義。結果見表2。

表2 3 組大鼠神經功能缺損評分比較 （分，x±s）

2.2 腦梗死面積觀察

假手術組腦切片基本呈現鮮紅色，模型組可見大面積灰白色梗死灶，電針組梗死灶面積明顯小于模型組。結果見圖1。

圖1 3 組大鼠腦梗死面積觀察

2.3 CACNα1D 在海馬中的表達

與假手術組比較，模型組CACNα1D mRNA表達量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組CACNα1D mRNA 表達量明顯降低 P＜0.01），差異有統計學意義。結果見表3、圖2。

表3 3 組大鼠海馬中CACNα1D mRNA 的表達 （x±s）

圖2 3 組大鼠海馬中CACNα1D mRNA 的表達

3 討 論

既往研究表明，電針神庭、百會穴能夠有效改善 MCAO 大鼠的神經功能狀況［6］。神庭、百會穴位于督脈上，與腦關系密切，《靈樞》中有督脈“入絡腦”的記載，另外，督脈為“陽脈之海”，人體陽氣足則氣化功能旺盛，生成氣血津液，使清陽得到充養，也能使氣血運行正常，經脈通暢，故歷代醫家有“病變在腦，首取督脈”的說法。根據現代研究表明，百會、神庭穴恰好位于與人的高級思維、記憶、精神密切相關的額、頂葉的投射區，針刺可引起神經和骨膜效應，影響和改善腦功能［7］。

鈣離子通過膜上鈣離子通透性通道，引起細胞內外離子電位的不同，從而引起各種活動。鈣離子通道廣泛存在于人體中，神經元細胞中通過電壓依賴性鈣離子通道內流的鈣離子是動作電位誘導的神經遞質釋放的關鍵［8］，CACNα1E 被證實能夠減少胰島素的分泌，增加患2 型糖尿病的風險［9］，CACNα1A 中的新型S218L 突變與家族性偏癱偏頭痛和輕度頭部外傷后延遲的致命性腦水腫和昏迷有關［10］。L 型鈣離子通道為高電壓激活通道，是由 α1S、α1C、α1D、α1F 幾個亞基特異形成的，其中 α1D 主要分布在大腦、心臟和內分泌組織［11］，在中樞神經系統的基因表達中發揮重要作用［12］。Veng LM 等［13］通過對比觀察年輕大鼠和老年大鼠的海馬發現，老年大鼠CACNα1D mRNA 的表達選擇性升高，這可能與CACNα1D mRNA 的表達上升后，通過L 型鈣通道內流的鈣離子過多有關，而過量流入的鈣離子對記憶形成有害，因此推測L 型鈣離子通道的電流在與年齡有關的記憶衰退中起重要作用。Xu Jiehua 等［14］通過對大鼠腦組織進行雙標記熒光染色后發現CACNα1D與鈣結合蛋白在大腦中不同位置的協同定位表明其對神經可塑性發揮重要作用并且兩者在脊髓背角II 層的共定位比例較高，說明傷害性傳遞的調節機制可能與L 型鈣離子通道和鈣結合蛋白有關。

在本研究中，模型組和電針組大鼠CACNα1D mRNA 表達量均高于假手術組，經過電針干預后，電針組大鼠海馬中CACNα1D mRNA 表達較模型組明顯下降（P＜0.01），推測可能由于電針干預后抑制了CACNα1D mRNA 的表達，減少了鈣離子的流入，進而影響動作電位的生成，以及后續神經遞質的釋放。但由于腦卒中病理機制的復雜性和電針干預效果的多靶點特征，對于電針改善腦卒中癥狀的機制還有待進一步研究。