海南油茶不育株花器發育生物學特性及解剖學觀察

賈澤沖 劉云豪 陳霞 王海 鄧雅潔 胡新文 周揚 龐真真 賴杭桂

摘 ?要：從解剖學、細胞生物學及遺傳學角度對海南油茶不育株花器發育過程導致不育的原因進行研究。以海南油茶正常株和不育株為實驗材料，對其花芽發育過程外部形態特性進行階段性比較觀察，并應用花粉原位萌發技術檢測其花粉萌發及花粉管發育差異;應用石蠟切片法對花芽分化過程中雌雄蕊進行解剖學觀察，分析雌雄蕊發育時期與其花芽外部形態的相關性。結果表明：不育花與正?；ㄍ獠啃螒B上并無明顯差異，但不育株開花后子房即脫落，表明沒有正常授精，不育株柱頭授粉后花粉粒不萌發，花粉管并不伸長;從雌雄蕊石蠟切片可以看出，不育株花器發育失常，其花藥的絨氈層降解異常，無法形成成熟花粉粒，而在其胚珠發育過程中不育株未能形成成熟胚囊，導致空心胚珠。

關鍵詞：海南油茶;不育株;花器;花粉原位萌發;解剖學觀察

中圖分類號：S794.4 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： The flowering sterility of Camellia vietnamensis is common in Hainan， which would seriously affect the production level of Camellia oil. In this study， the normal and sterile plants of C. vietnamensis in Hainan were used as the experimental materials， the external morphological characteristics of flower bud development were compared and observed， and the differences of pollen germination and pollen tube development were detected by the pollen in situ germination technique. The paraffin section method was used to observe the pistil and stamen during flower bud differentiation， and the correlation between the period of pistil and stamen development and the external morphology of flower bud was analyzed. In this study， the causes of sterility caused by flower organ development of C. vietnamensis in Hainan were analyzed in developmental biology， reproductive genetics and cell anatomy. There was no significant difference in the external morphology between the sterile flower and the normal flower， but the ovary of the sterile plant fell off after flowering， indicating that there was no normal insemination， the pollen grain did not germinate and the pollen tube did not elongate after stigma pollination. From the paraffin sections of pistil and stamen， it could be seen that the flower organ of the male sterile plant was abnormal， the tapetum of the anther was abnormally degraded and could not form mature pollen grains， but the sterile plant failed to form a mature embryo sac in the process of ovule development， resulting in hollow ovules.

Keywords： Camellia vietnamensis; sterile plant; floral organ; pollen in situ germination; anatomical observation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.013

油茶為山茶科（Theacea）山茶屬（Camellia）多年生木本油料作物，由蟲媒異花授粉的雙子葉植物，是典型的花果同時發育多年生常綠樹種，我國重要的木本油料樹種之一，主產于我國南方各省，在我國已有兩千多年的栽培歷史[1-3]。海南油茶（俗稱“山柚”）與內地普通油茶具有明顯區別，目前，學術界普遍認為海南油茶泛屬越南油茶種（Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu），越南油茶主要分布在我國的海南省、廣東南部，以及越南、老撾等地，也稱為陸川油茶，民間俗稱高州油茶、大果油茶、白花油茶[4]。海南的茶油，亦稱“山柚油”，香氣濃郁、營養價值高，具有“東方橄欖油”之美稱[5-6]。海南地處熱帶地區，因此種植海南油茶具有巨大的經濟價值及發展優勢。近年來，我國食用油供需矛盾突出，而油茶作為我國特有的木本油料作物，雌雄同花，異花授粉且產品為果實，其產業經濟效益差、產量低等問題明顯[7-8]，并且目前海南栽培種植區大多為實生樹，由于低產實生樹產果量少、出油率低，大小年現象明顯，大面積種植的油茶實生樹嚴重制約了海南油茶產業的發展，因此，選育和推廣油茶優良無性系種植材料顯得十分重要。

在海南油茶實生樹群體中，油茶不育株現象普遍存在，花器敗育而導致開花不結實是造成油茶林低產的重要因素之一。通過對海南油茶不育株花器發育過程進行觀察研究，不僅可揭示油茶不育株不育的生殖學原因，為油茶實生樹低產林改造提供生產依據，而且還可通過對油茶花器不育遺傳機制的研究，利用其雄性或雌性不育的遺傳特性，進行有性雜交育種及創新油茶雜種優勢利用途徑。

近年來，有關植物花粉原位萌發技術已普遍應用于農作物、蔬菜、花卉、林木等有性生殖與雜交育種研究[9-12]。也有研究人員就普通油茶的花粉形態結構掃描電鏡觀察、雄性不育優良無性系選育、雌性不育原因探討等方面進行了少量研究[13-15]，但海南油茶不育株花器官發育方面的研究鮮有報道。本實驗以海南油茶正常株和不育株為實驗材料，從解剖學、細胞生物學及遺傳學角度對海南油茶不育株花器發育過程導致不育的原因進行研究。對其花芽發育過程外部形態特性進行階段性比較觀察，并應用花粉原位萌發技術檢測其花粉萌發及花粉管發育差異;應用石蠟切片法對花芽分化過程中雌雄蕊進行解剖學觀察，分析雌雄蕊發育時期與其花芽外部形態的相關性。初步揭示海南油茶花器不育的相關細胞學遺傳機制，不育株不育的生殖學原因，為海南油茶實生樹低產林改造提供生產依據;利用其不育遺傳特性來進行有性雜交育種，可為今后創新油茶雜種優勢利用途徑等方面的研究奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料于2018年12月采自海南省澄邁縣福山鎮侯臣生物科技有限公司油茶種植基地，不育株與正常株樹齡15 a，樹勢中等，不育株開花但不結果，正常株生長結果正常。基地位于1923N，10900E，海拔21～300 m，年平均氣溫23.1～ 24.4 ℃，年平均雨量2000～5000 mm左右，平均相對濕度89%，年平均光照1900 h。試驗基地肥水條件良好，立地條件和管理措施完全一致。

1.2 ?方法

1.2.1 ?花粉原位萌發方法 ?試驗在植株開花當天2018年12月28日進行，分別以海南油茶正常株和不育株為母本，采集其他正常株花粉進行異株授粉并套袋隔離，以避免油茶自交不親和性的影響。在授粉后5 h開始采樣用于比較觀察柱頭上花粉粒萌發及花粉管生長。

參照Burke[16]和Hiratsuka等[17]的花粉原位萌發方法，并作部分修改，具體流程如下：分別于授粉后5、10、20 h取樣，每次取海南油茶正?；ê筒挥ǜ?朵，去除萼片后取柱頭連同子房在卡諾氏固定液（V95%乙醇：V冰醋酸=3：1）中固定24 h，取出柱頭用95%乙醇洗滌3～4次，置于70%乙醇容器中，4 ℃冰箱中保存備用。觀察時，柱頭用2 mol/L NaOH軟化1 h，蒸餾水沖洗3次以上，再用1%水溶性苯胺藍染色8～12 h，然后把柱頭置載玻片上，滴適量蒸餾水，加蓋玻片輕輕壓平，用熒光顯微鏡Olympus BX51TR-32FA1-A03在WU （寬帶紫外光激發）下進行觀察，Image-Pro Plus軟件拍照。由于油茶的花柱較長，所以圖片先局部拍照，然后用Photoshop軟件拼接成完整花柱圖。

1.2.2 ?海南油茶正常株與不育株花器形態及解剖學差異觀察 ?（1）海南油茶正常株和不育株花芽外部形態觀察及測量。油茶的內部發育時期和花芽或花形態特征之間存在著一一對應的關系[1]。觀察供試材料外部形態差異，把花芽從小到大不同發育時期分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4級，即Ⅰ級：花芽開始萌動，芽鱗堅硬且有開裂趨勢;Ⅱ級：芽鱗張開，稍微露蕾;Ⅲ級：芽鱗脫落，花蕾露出;Ⅳ級：花朵含苞待放，個別花朵已開放。按照4級外部形態差異進行取樣，樣品采自樹冠外圍短枝上的花芽，每次采正常株與不育株花芽各30個（花芽大小均勻一致），自花芽萌動開始進行采樣（Ⅰ級），根據花芽發育速度，每3 d采樣1次，采樣時間為上午9：00—10：00時，集齊Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4級樣品。每級隨機選取正常株與不育株花芽各20個，對其縱徑（長）和橫徑（寬）采用游標卡尺進行測量，取平均值（mm）進行生長發育不同時期的花型指數（花芽縱橫徑之比）差異顯著性分析。

（2）石蠟切片方法。參照楊虎彪等[18]的植物石蠟制片改良方法，并作部分修改，具體流程如下：采集新鮮材料固定于FAA固定液中（70%乙醇 ：甲醛 ：冰醋酸=90 ： 5 ：5），抽氣，固定24 h。用70%乙醇洗滌3次后，用梯度濃度為70%～100% 的乙醇徹底脫水。經脫水后再通過梯度性改變正丁醇和酒精比（置于正丁醇：無水乙醇=1： 1中1 h，取出，轉入正丁醇中靜置1～2 h，再取出轉入正丁醇中放置1～2 h）以進行透明處理。然后將材料浸蠟，浸蠟結束后便立即包埋材料，修塊，將材料固定在LEICA RM2235切片機上（厚度調至10 μm）手搖切片，置于展片臺上展片，45 ℃烘片12 h以上。烘片后用有機溶劑（二甲苯和乙醇）逐步脫蠟。最后采用固綠或者番紅固綠對染，并以中性樹膠封片保存。使用Olympus BX51顯微鏡觀察切片并拍照。

2 ?結果與分析

2.1 ?花粉萌發及花粉管發育特征觀察

熒光原位萌發的觀察結果顯示，海南油茶正常株的花粉粒萌發及花粉管生長正常（圖1A），但不育株柱頭上的花粉粒幾乎不萌發，花粉管不發育（圖1B）。正常株授粉后，花粉萌動首先從花粉的萌發孔突出花粉管，萌發的花粉管呈亮綠色，基部管節有時可見明顯膨大（圖1D）?；ǚ酃苓M入花柱引導組織后向下呈直線生長（圖1C），顯微鏡下可見大量花粉管成束狀于花柱中（圖1A）。在生長的過程中，花粉管只在長度上持續增加，而直徑變化不大。不育株授粉后，花粉管不伸長，沒有花粉管能夠到達柱頭底部，穿過子房完成受精。

2.2 ?海南油茶正常株與不育株花器形態及解剖學差異

2.2.1 ?油茶正?；ㄅc不育花形態差異 ?正常花和不育花分別選取4個發育時期：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，各時期花芽外部形態見圖2 A和B（時期Ⅰ：花芽呈綠色，鱗片硬;時期Ⅱ：花芽體積增大，綠色變淺;時期Ⅲ：芽鱗開裂，露出嫩黃花瓣;時期Ⅳ：花芽開綻，芽鱗黃綠色且張開，露出白色花瓣）。正常株花藥飽滿呈黃色，有黃色粉末狀花粉粒散出;而不育株花藥瘦小干縮，顏色呈褐色，非正常色澤，且無花粉粒散出（圖2C）。比較正常株與不育株的子房發育，可見正常株子房發育膨大，而不育株開花幾天后子房干癟即將脫落（圖2D）。

通過對海南油茶正常株和不育株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個生長發育時期花芽的縱橫徑進行測定（圖3），方差分析結果表明，各個時期不育株花芽縱橫徑均值，均顯著高于正常株花芽縱橫徑均值，但未達到極顯著差異，因此從花芽外觀上可以初步判斷不育株花器要略微大于正常株花器。

對正?；ê筒挥ㄉL發育4個不同時期的花型指數（縱徑/橫徑）進行比較分析。結果顯示，正?；ê筒挥ǖ幕ㄐ椭笖翟诨ㄑ可L發育過程的4個時期差異都不顯著（表1），其花芽形狀、鱗片、花瓣顏色等發育一致（圖2A、B），表明2種類型的花芽在各發育階段是一致的，其花型指數的外觀形態并不存在明顯差異。

通過對比油茶正?；ê筒挥ㄍ獠啃螒B，明顯看出不育花的雄性器官結構異常（圖2C）。不育花花藥瘦小干縮，顏色呈褐色，非正常色澤。從外部形態分析，不育原因為結構性雄性不育。除此以外，海南油茶正常株與不育株開花后子房形態差異也非常顯著，正常株開花后子房正常發育膨大，然而不育株開花后子房干癟，且有脫落趨勢（圖2D）。

2.2.2 ?正常株與不育株的花藥發育觀察 ?采用石蠟切片法來比較觀察正?；ê筒挥ǖ慕馄蕦W差異。4個發育時期正?；ê筒挥ɑㄋ幗Y構的對比觀察情況見圖4。

正常株油茶花粉壁的發育屬基本型，花粉壁由表皮層、藥室內壁、中層和絨氈層組成，將花粉母細胞圍繞在其中心。隨著減數分裂后胼胝質降解，單核小孢子從四分體中游離出來。剛釋放出來的單核小孢子排列不規則，細胞壁薄，細胞質濃，細胞核位于細胞中央，絨氈層降解，開始脫離中層（圖4A）;正常株單核小孢子繼續發育，體積增大，大多數細胞核從細胞中心移至細胞一側，花粉發育的單核靠邊期形成，此時，絨氈層繼續降解（圖4B）;接下來正常株小孢子進入有絲分裂，生成2個核，表面略微凹陷，形成2個細胞，即相對較小的生殖細胞和較大的營養細胞，此時，花粉發育進入二核時期，雙核花粉積累營養物質，顏色較深，絨氈層進一步解體，絨氈層核消失，內含物消失（圖4C）;正常株逐漸進入花粉成熟時期，花粉粒形態均勻，體積增大，染色深，充滿營養物質，兩個相鄰的花粉囊相通，絨氈層完全解體消失（圖4D）。

不育株花藥同樣具有表皮層、藥室內壁、中層和絨氈層結構，但不明顯。相比之下，4個時期不育花花藥結構中，幾乎觀察不到發育正常的花粉粒，絨氈層幾乎未降解，內含物未消失，乃至兩個相鄰花粉囊均相互連通的成熟時期，絨氈層依然存在（圖4 E～H）。絨氈層是花藥的一種特化組織，位于花粉囊壁最內層，其主要功能是產生和輸送給小孢子正常發育所必需的酶、生長素和營養物質，為花粉粒的發育提供代謝所需要的物質，對花粉的形成起著關鍵的作用。絨氈層發育不正常是導致花粉敗育的一個主要原因，絨氈層細胞發育畸型，導致營養物質滯留在絨氈層細胞內部，無法運輸到小孢子中，使得花粉發育得不到正常生長所需的營養物質，引起敗育[1]。

2.2.3 ?正常株與不育株的胚囊發育觀察 ?正?；ê筒挥ㄅ吣医Y構的對比觀察情況見圖5。正?；〞r期Ⅰ處于大孢子母細胞時期，大孢子母細胞體積大，核大，細胞質較濃，位于一層珠心表皮下（圖5A）;接下來功能性大孢子中心出現橢圓形的大液泡，細胞核進行第1次減數分裂，形成二分體（圖5B）;保留的二分體繼續完成減數Ⅱ分裂，形成的二核胚囊繼續有絲分裂，即將形成四核胚囊（圖5C）;正?；ǖ臅r期Ⅳ胚囊里，可觀察到趨于成熟的胚囊結構（圖5D）。而不育株出現明顯的胚囊異常，未能形成大孢子母細胞（圖5E），減數分裂不能起始或完成（圖5F），處于發育成熟的胚囊絕大多數胚珠中心是空的，未見卵細胞、極細胞及反足細胞，無形成正常胚囊的趨勢（圖5G～H）。導致植物產生雌性不育的原因有很多，胚珠作為種子的前體器官，其敗育會產生最直接和最徹底的影響，導致雌性不育或育性降低。胚囊自身發育異常，大孢子母細胞不能形成，減數分裂不能起始或完成，這是胚珠敗育的主要類型[19]。

2.2.4 ?海南油茶雌雄蕊發育時期與其花芽外部形態的對應關系 ?本試驗海南油茶4個發育時期花芽的外部形態變化主要表現為芽鱗堅硬且有開裂趨勢（時期Ⅰ）;芽鱗張開，稍微露蕾（時期 Ⅱ）;芽鱗脫落，花蕾露出（時期 Ⅲ）;花朵含苞待放（時期 Ⅳ）。

海南油茶雌雄蕊發育時期和花芽或花形態特征之間存在著一定的對應關系（表2）。通過觀察外部形態和石蠟切片圖，不難看出，時期Ⅰ，芽鱗堅硬（圖2A），此時胚珠內孢原細胞發育成為大孢子母細胞（圖5A），雄蕊發育處于單核小孢子中央期（圖4A）;時期Ⅱ，芽鱗張開，稍微露蕾（圖2A），雌蕊發育至二分體時期（圖5B），雄蕊發育進入單核花粉時期（圖4B）;時期 Ⅲ，芽鱗脫落，花蕾露出（圖2A），細胞活動活躍，雌蕊開始形成二核或四核胚囊（圖5C），花藥內部進入二核花粉時期（圖4C）;時期 Ⅳ，花朵含苞待放（圖2A），出現成熟胚囊（圖5D），且雄蕊花粉發育成熟（圖4D）。

3 ?討論

花粉在柱頭上的萌發及生長狀況是雜交親和性的一項重要內容，花粉萌發和花粉管生長也是實現受精作用的首要步驟，在高等植物有性生殖過程中起重要作用[20-22]。本研究采用花粉原位萌發技術，授粉后采下柱頭，通過苯胺藍染色法對花粉管進行染色，可有效在熒光顯微鏡下觀察到油茶花粉粒在柱頭上萌發及花粉管生長情況。運用花粉管熒光標記能夠直接判斷高等植物在自交、異交過程中花粉萌發及花粉管的生長情況[11]。苯胺藍能夠有效地標記花粉管，花粉管在花柱區內穿行時產生大量的胼胝塞，產生強烈熒光，因此采用熒光顯微鏡法能快速測定植物授粉的親和性[23]。研究發現，海南油茶正常株和不育株間花粉粒萌發及花粉管生長情況存在差異。海南油茶正常株的花粉粒萌發及花粉管生長正常，海南油茶不育株的花粉粒幾乎不萌發，花粉管不發育。由此可見，海南油茶不育株花粉萌發和花粉管生長不正常，其受精作用受阻。

植物的有性生殖對于其生命的延續和種群的拓展起著決定性的作用，該過程的任何一個環節出現障礙，都會造成生殖的失敗[1]。通過海南油茶正?；ê筒挥ㄍ獠啃螒B觀察對比可以看出，雖然兩者在花芽外部形態上并無明顯差異，但不育花花藥瘦小干縮，顏色呈褐色，非正常色澤，為結構性雄性不育;從解剖觀察海南油茶正常株及不育株的發育過程表明，海南油茶正常株的花藥和胚囊結構發育完全正常，但切片觀察海南油茶不育株幾個相同發育時期，其雌雄蕊敗育現象明顯，有別于正常株：4個時期正常株花藥結構分別處于單核時期、單核靠邊期、二核時期和花粉成熟期，各部分結構發育正常，但分別對應的不育花花藥的絨氈層發育和降解異常，到達花粉成熟期兩個相鄰花粉囊雖均相互連通，但均未形成成熟花粉粒;4個時期正常株胚囊結構分別處于大孢子母細胞時期、二分體時期、二核胚囊有絲分裂期、成熟胚囊期，而不育株出現明顯的胚囊發育異常。花粉的正常發育是實現受精結實的保證。然而，植物群體中存在花粉敗育的個體，導致雄性不育[24]。究其敗育的原因，絨氈層發育和降解的異常，往往會影響花粉粒的正常發育，有研究認為花粉敗育是由于絨氈層細胞在花粉形成和發育過程中提前或延后退化[25]。絨氈層解體后其產物可以為花粉合成 DNA、RNA、蛋白質、淀粉等提供原料，因此絨氈層發育異常會影響小孢子發育，最終導致花粉部分或完全敗育[26]。胚囊發育異常，會導致雌性不育或育性降低[20]。因此判定海南油茶不育株不育原因為有性生殖過程中，雄性生殖結構與雌性生殖結構發育異常，使得無法形成成熟胚囊及成熟花粉粒，受精過程嚴重受阻，造成生殖失敗，形成海南油茶不育株。陳永忠等[14]研究普通油茶觀察到植株雄性不育，但是雌性正常，異花授粉后可正常開花結實，而本研究觀察到海南油茶開花不結實現象，經實驗證明為雌雄均表現不育性。

海南油茶花期長，花量大，但實生樹結果少甚至不結果現象是造成海南油茶低產的關鍵因素，也制約了海南油茶產業的發展。該種植基地有6.67 hm2 15齡實生油茶林，不育株比例約占3%～5%。油茶作為多年生的木本油料作物，優質、高產始終是油茶研究的重要目標。為推進油茶優質、高產，更要重視海南本地油茶的優株篩選，加快海南油茶品種選育，大力推廣本地區優良品種，同時加強油茶林科學管理，良種良法，培育新一代高產、優質聚合品種，以油茶高產優質為目的，為海南油茶的大面積推廣和豐產栽培奠定基礎。

本研究通過對海南油茶不育株及正常株花粉原位萌發及花器發育過程進行解剖學觀察，分析油茶不育株在花器形態、結構及其大小孢子形成方面與正常株的差異，初步揭示了發生油茶花器不育相關的遺傳機制，為海南油茶正常株和不育株的發育特性差異方面積累一些原始資料，對海南油茶的遺傳學研究有著重要的指導意義。從海南油茶生殖發育過程可以看出，準備開花及開花期間是性細胞發育的重要時期，此時正值雌雄配子體的發育階段，需要營養供應充足、環境條件良好以滿足其進行生殖發育。下一步的研究應對海南油茶不育株從轉錄組方面進行測序和分析，對導致不育的基因進行相關探討，以期利用其雄性或雌性不育的遺傳特性，進行有性雜交育種，創新油茶雜種優勢利用途徑，為油茶實生樹低產林改造提供生產依據，早日建立高產、穩定的油茶體系。

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