限食后重飼大鼠的骨密度變化及白藜蘆醇干預(yù)效果▲

王素星 邵偉華 李 偉 呂彩霞 張華星 李 芳

(河北省人民醫(yī)院1 老年病二科，2 老年病一科，3 醫(yī)務(wù)處，石家莊市 050051，電子郵箱：wangsuxing@126.com)

限食后的重飼是指短期熱卡限制后重新開放飲食，這可導(dǎo)致能量攝入的波動(dòng)。不適當(dāng)限食減肥后飲食反彈、疾病和疾病的康復(fù)等均伴隨熱卡攝取的波動(dòng)[1]。人體的各種生理活動(dòng)都離不開能量的支持，能量供應(yīng)的量與質(zhì)產(chǎn)生波動(dòng)均可影響人體的各種生理活動(dòng)，導(dǎo)致機(jī)體代謝發(fā)生一系列改變[2]。骨骼代謝與能量供給密切相關(guān)，慢性食物剝奪及兒童期營(yíng)養(yǎng)不良均對(duì)骨代謝有負(fù)面影響。有研究顯示，營(yíng)養(yǎng)剝奪可激活自噬，后者抑制成骨細(xì)胞分化增殖，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[3]，進(jìn)而負(fù)性調(diào)控骨代謝。白藜蘆醇是一種存在于紅酒中的多酚，可以抑制脂肪生成，刺激脂肪分解，增加脂肪酸氧化和熱生成[4]。同時(shí)，白藜蘆醇能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞DNA合成，使成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶和脯氨酰羥化酶活性明顯增加[5]，也可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激引起的損傷抑制骨質(zhì)流失[6]，由此可見白藜蘆醇與骨代謝亦密切相關(guān)。雙能 X線吸收測(cè)量(dual energy X-ray absorptiometry,DEXA)的輻射量較小，具有更高的精確度，已經(jīng)成為臨床上測(cè)量骨密度的常用方法[7]。本研究通過(guò)限制熱卡再快速恢復(fù)不同飲食模式的方法，建立限食后重飼成年大鼠模型，采用DEXA檢測(cè)全身骨密度，觀察能量供給改變過(guò)程中不同膳食模式重飼對(duì)骨密度的影響，以及白藜蘆醇的干預(yù)效應(yīng)及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體級(jí)SD雄性大鼠64只，體質(zhì)量(160±20)g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(冀)2013-1-003。大鼠常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2 試劑及儀器 電子秤(精確到0.1 g)購(gòu)自佛山市順德區(qū)山和電子衡器有限公司(型號(hào)：SH0001)；血糖儀購(gòu)自強(qiáng)生(中國(guó))醫(yī)療器材有限公司(型號(hào)：ONE TOUCH UltraVue)；微量輸注泵購(gòu)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司(型號(hào)：WZ-50G)；DEXA儀購(gòu)自美國(guó)GE Lunar公司(型號(hào)Lunar iDXA)。重組人胰島素購(gòu)自諾和諾德(中國(guó))制藥有限公司(批號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字：J20130021)；血清胰島素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司(批號(hào)：E-EL-R2466c、E-EL-R1860c、E-EL-R0019c、E-EL-R0015c)。普通飼料購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，高脂飼料參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行配制。白藜蘆醇(粉劑，純度99%，Sigma公司)用生理鹽水配制成15 mg/mL懸濁液備用。

1.3 研究方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周后，使用隨機(jī)數(shù)字表將其分為正常飲食組16只、限食后重飼組24只、限食后重飼+白藜蘆醇干預(yù)組24只。再將正常飲食組分為NC4組和NC12組各8只，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均給予正常飲食；限食后重飼組分為3個(gè)亞組各8例，即R4組(限食4周)、RN組(限食4周后給予正常飲食8周)、RH組(限食4周后給予高脂飲食8周)；限食后重飼+白藜蘆醇干預(yù)組分為3個(gè)亞組各8例，即R4R組(限食4周的同時(shí)給予白藜蘆醇干預(yù))、RNR組(限食4周后給予正常飲食加白藜蘆醇8周干預(yù))、RHR組(限食4周后給予高脂飲食加白藜蘆醇干預(yù)8周)。限食后重飼組及限食后重飼+白藜蘆醇干預(yù)組大鼠限食期間均給予60%正常飲食組大鼠的食量喂養(yǎng)；限食后重飼+白藜蘆醇干預(yù)組大鼠在飲食干預(yù)期間給予100 mg/kg白藜蘆醇灌胃，其他兩組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。分組示意圖見圖1。

圖1 分組示意圖

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 體重：每日稱量大鼠體重及食物攝入量(精確至0.1 g)。

1.4.2 全身骨密度測(cè)定：在實(shí)驗(yàn)第4周末(NC4組、R4組、R4R組)和第12周末(RN組、RH組、RNR組、RHR組)，大鼠禁食過(guò)夜，精確稱量體重后，按30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，待大鼠肌力消失、呼吸平穩(wěn)，仰臥位下用膠帶將大鼠四肢固定于硬紙板，采用DEXA儀從鼻尖掃描至尾端行全身骨密度測(cè)定。

1.4.3 高胰島素-正糖鉗夾試驗(yàn)檢測(cè)：在實(shí)驗(yàn)第4周末(NC4組、R4組、R4R組)和第12周末(RN組、RH組、RNR組、RHR組)，大鼠限食過(guò)夜后，參考文獻(xiàn)[9]，在大鼠清醒狀態(tài)下行尾動(dòng)靜脈插管高胰島素-正糖鉗夾試驗(yàn)(以下簡(jiǎn)稱正糖鉗夾試驗(yàn))，檢測(cè)鉗夾60～120 min內(nèi)葡萄糖輸注率(glucose infusion rate during 60 to 120 minutes,GIR60-120)。正糖鉗夾試驗(yàn)開始前留取尾靜脈空腹血。

1.4.4 FFA、TNF-α、IL-6的檢測(cè)：取1.3.3留取的血標(biāo)本，離心(3 000 r/min，15 min)，留取血清，采用ELISA檢測(cè)FFA、TNF-α、IL-6水平，所有操作均按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。符合正態(tài)分布的兩指標(biāo)相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，不符合正態(tài)分布的兩指標(biāo)相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。采用多元逐步回歸分析全身骨密度與各個(gè)變量之間的關(guān)系，同時(shí)行共線性檢驗(yàn)，排除相關(guān)性強(qiáng)的影響因素。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 限食對(duì)大鼠體重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影響 實(shí)驗(yàn)第4周末，NC4組、R4組、R4R組的體重、骨密度依次降低(均P<0.05)；NC4組、R4R組、R4組的血清FFA水平依次升高(均P<0.05)，而3組間GIR60-120差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；R4組、R4R組的血清TNF-α和IL-6水平均低于NC4組(均P<0.05)，但R4組、R4R組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 NC4組、R4組、R4R組各指標(biāo)比較(x±s)

2.2 限食后重飼情況對(duì)大鼠體重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影響 實(shí)驗(yàn)第12周末，RN組、RH組的體重均低于NC12組(均P<0.05)，但RN組與RH組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；RH組的骨密度低于其他兩組(均P<0.05)；NC12組、RN組、RH組GIR60-120依次降低，而血清FFA、TNF-α、IL-6水平依次升高(均P<0.05)。見表2。

表2 NC12組、RN組、RH組各指標(biāo)比較(x±s)

2.3 限食后正常飲食及白藜蘆醇干預(yù)對(duì)大鼠體重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影響 實(shí)驗(yàn)第12周末，NC12組、RN組、RNR組的體重依次降低，RNR組骨密度高于其他兩組(均P<0.05)；RNR組GIR60-120高于NC12組(P<0.05)；NC12組、RNR組、RN組的血清FFA、TNF-α水平依次升高，且RN組血清IL-6水平高于其他兩組(均P<0.05)。見表3。

表3 NC12組、RN組、RNR組各指標(biāo)比較(x±s)

2.4 限食后高脂飲食及白藜蘆醇干預(yù)對(duì)大鼠體重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影響 實(shí)驗(yàn)第12周末，NC12組、RH組、RHR組的體重依次降低，RH組、NC12組、RHR組的骨密度依次升高，NC12組、RHR組、RH組的GIR60-120依次降低，血清FFA、TNF-α、IL-6水平依次升高(均P<0.05)。見表4。

表4 NC12組、RH組、RHR組各指標(biāo)比較(x±s)

2.5 影響骨密度的因素 取12周組大鼠，分析其骨密度與體重、GIR60-120值及FFA、TNF-α、IL-6水平的相關(guān)性。相關(guān)分析結(jié)果顯示全身骨密度與體重、GIR60-120呈正相關(guān)(r=0.634，P<0.001；r=0.745，P<0.001)，與血清FFA、TNF-α、IL-6水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.721，P<0.001；r=-0.644，P<0.001；r=-0.613，P=0.013)。以骨密度為因變量，體重、GIR60-120值及FFA、TNF-α、IL-6水平為自變量進(jìn)行逐步回歸分析(均納入實(shí)際測(cè)量值進(jìn)行分析)，結(jié)果顯示GIR60-120、FFA水平是影響全身骨密度的因素(均P<0.05)。見表5。

表5 骨密度影響因素的多因素分析

3 討 論

本研究中，RH組大鼠骨密度低于NC12組及RN組(P<0.05)，而NC12組及RN組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示限食后給予高脂飼料重飼可導(dǎo)致大鼠骨密度降低。研究表明，胰島素抵抗可影響1α-腎羥化酶的活性，以及腎臟對(duì)鈣、磷的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致鈣流失增多；其還可以導(dǎo)致甲狀旁腺激素等激素分泌異常，進(jìn)而影響骨代謝[10]。正糖鉗夾試驗(yàn)中GIR60-120是評(píng)價(jià)胰島素敏感性的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，NC12、RN組、RH組的GIR60-120依次降低(P<0.05)，提示限食后給予高脂飼料重飼大鼠存在更為嚴(yán)重的胰島素抵抗；同時(shí)大鼠的GIR60-120與骨密度呈正相關(guān)，是骨密度的影響因素(P<0.05)，提示限食后給予高脂飼料重飼大鼠出現(xiàn)的更為嚴(yán)重的胰島素抵抗導(dǎo)致骨密度降低。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，脂肪酸對(duì)成骨細(xì)胞具有脂毒性作用[11],抑制脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的合成可以保護(hù)成骨細(xì)胞。有研究表明，營(yíng)養(yǎng)變遷過(guò)程中內(nèi)臟脂肪組織的脂質(zhì)生成能力增強(qiáng)，而儲(chǔ)存能力相對(duì)不足[1]。本研究結(jié)果顯示，RN組及RH組大鼠分別給予正常飼料及高脂飼料重飼后FFA水平均升高(P<0.05)，考慮與脂質(zhì)生成和儲(chǔ)存失衡導(dǎo)致的脂質(zhì)外溢有關(guān)；同時(shí)，F(xiàn)FA水平與骨密度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示血清中蓄積的FFA達(dá)到一定程度可能會(huì)對(duì)骨質(zhì)產(chǎn)生破壞作用；而RH大鼠FFA水平高于RN組(P<0.05)，表明高脂飲食重飼后顯著升高的FFA水平可能是骨密度降低的影響因素之一。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)是腫瘤壞死因子超家族的成員，在破骨細(xì)胞前體向破骨細(xì)胞的分化中起著關(guān)鍵作用[12]，可以促進(jìn)骨吸收。當(dāng)機(jī)體存在炎癥反應(yīng)時(shí)，TNF-α、IL-6等炎性物質(zhì)使組織處于一種“慢性炎癥”環(huán)境中，RANKL表達(dá)上調(diào)，骨吸收被抑制。本研究中，分別給予正常飼料及高脂飼料重飼后，RN組和RH組大鼠的TNF-α、IL-6水平升高，且RH組的水平更高(P<0.05)。TNF-α、IL-6是經(jīng)典的炎癥因子，因此我們推測(cè)高脂飼料重飼后出現(xiàn)骨密度降低，可能與其機(jī)體更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)對(duì)骨代謝影響更為明顯有關(guān)。

白藜蘆醇，化學(xué)名稱為3,5,4′-三羥基二苯乙烯，是一種結(jié)構(gòu)類似雌激素己烯雌酚的天然多酚類化合物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[13]。研究顯示，白藜蘆醇在體外能與雌激素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體，具有雌激素/抗雌激素樣作用，被視為一種植物雌激素，而雌激素對(duì)骨質(zhì)疏松有治療作用[14]。本研究結(jié)果顯示，與單純限食后重飼組(RN組及RH組)比較，限食后無(wú)論給予正常飼料還是高脂飼料重飼，白藜蘆醇干預(yù)組(RNR組及RHR組)的大鼠骨密度升高，且GIR60-120亦升高，F(xiàn)FA、TNF-α、IL-6水平均降低。這提示白藜蘆醇可能通過(guò)降低胰島素抵抗，減少FFA生成從而升高大鼠骨密度；同時(shí)白藜蘆醇還可能通過(guò)減少脂質(zhì)外溢、減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而糾正骨代謝的內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)骨生成。此外，與單純限食后重飼組比較，限食后無(wú)論給予正常飼料還是高脂飼料重飼，白藜蘆醇干預(yù)組的大鼠體質(zhì)量下降，但骨密度升高(P<0.05)。因此，我們認(rèn)為獨(dú)立于體質(zhì)量的重力負(fù)荷和機(jī)械刺激外，白藜蘆醇可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮骨保護(hù)作用。有研究顯示，白藜蘆醇可通過(guò)多種途徑正性調(diào)控骨代謝。例如，核心結(jié)合因子α-1是最早發(fā)現(xiàn)且最具特異性的成骨標(biāo)志物，沉默信息調(diào)節(jié)因子-1通過(guò)去乙酰化核心結(jié)合因子α-1，直接調(diào)節(jié)核心結(jié)合因子α-1，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[15]，而白藜蘆醇作為最有效的沉默信息調(diào)節(jié)因子-1的激活劑之一[6，16]，在該過(guò)程發(fā)揮重要作用。白藜蘆醇還可激活腺苷酸活化蛋白激酶，后者通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞功能[17]。但本研究結(jié)果亦顯示，限食4周的同時(shí)給予白藜蘆醇干預(yù)的R4R組大鼠骨密度低于單獨(dú)限食的R4組，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是：食物剝奪使得骨形成所需的基本原料減少，從而抑制了成骨細(xì)胞的活性；同時(shí)，相對(duì)嚴(yán)重的食物缺乏(減少40%的食物攝入)激活了機(jī)體能量守恒機(jī)制，能量被優(yōu)先分配到關(guān)鍵器官，以確保生命的基本代謝活動(dòng)，導(dǎo)致白藜蘆醇無(wú)法發(fā)揮骨骼的保護(hù)作用。因此，我們考慮白藜蘆醇的骨骼保護(hù)作用還依賴于機(jī)體能量供給。

綜上所述，與正常飲食重飼相比，高脂飲食重飼大鼠全身骨密度及胰島素敏感性下降更明顯，白藜蘆醇可能通過(guò)改善限食后重飼大鼠的胰島素抵抗，降低FFA生成及炎癥因子釋放，從而提高骨密度。但這種對(duì)骨骼的保護(hù)作用有賴于充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，而白藜蘆醇在營(yíng)養(yǎng)變遷大鼠模型中對(duì)骨代謝影響的具體分子生物學(xué)機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。