酶解-超聲偶聯法提取桔梗莖葉總黃酮的工藝研究

許一平 王新功 梁偉玲 李璐 宋昕(山東中醫藥高等專科學校，山東 煙臺 264199)

0 引言

桔梗(Platycodon grandiflorum(Jacq.) A. DC.)為桔梗科桔梗屬多年生草本植物，是藥食同源的傳統中藥[1]，其根為藥用部位，主要含有三萜皂苷、黃酮類化合物等活性成分。桔梗莖葉是桔梗的地上部位，現代研究表明，桔梗莖葉中含有皂苷類、黃酮類等活性成分，其提取物具有明顯的抗炎、祛痰等生理活性作用[2-3]，其中的黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤及抗氧化活性等[4]。文章以總黃酮得率作為評價指標，采用纖維素酶-超聲波偶聯提取桔梗莖葉中總黃酮，在考察單因素的基礎上，采用正交試驗設計優化提取工藝條件，為進一步開發和利用桔梗非藥用部位資源桔梗莖葉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

桔梗莖葉采摘于山東省煙臺市本校中草藥種植基地，經山東中醫藥高等專科學校中藥鑒定教研室王蘇麗教授鑒定為桔梗科桔梗屬植物桔梗的莖葉。將采收的新鮮桔梗莖葉除去雜質，用純水洗凈后，置干燥箱中50℃干燥，取出粉碎，過100目篩，備用；蘆丁標準品(中國藥品檢定研究院)；纖維素酶(3×104U/g)(安徽博美生物科技有限公司)；乙醇，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁(天津市科密歐化學試劑有限公司)；試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

KQ3200E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TU-1901型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；FZ102型微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；GZX-9246MBE 型電熱鼓風干燥箱(上海博迅醫療設備廠)；RE-2000A型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-Ⅲ型循環水式真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；HH-4型數顯恒溫水浴鍋(金壇市城東新瑞儀器有限公司)；BSA224S-CW 電子天平(北京賽多利斯有限公司)；Satorious PB-10酸度計(德國賽多利斯貿易有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品的制備

精密稱取115℃干燥至恒重的蘆丁標準品10mg，用60%乙醇充分溶解并定容至50mL 容量瓶中，搖勻，得濃度為0.2mg/mL的蘆丁標準溶液。

1.2.2 標準曲線繪制

精確移取蘆丁標準溶液0.0、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL，分別置于10mL 容量瓶中，用60%乙醇補充至5mL，加5%亞硝酸鈉0.5mL，混勻靜置6min，再加10%硝酸鋁0.5mL，混勻，放置6min，加4%氫氧化鈉4.0mL，以60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min。以試劑為空白對照，在510nm 波長處分別測定吸光度。以吸光度值Y為縱坐標，以對照品溶液質量濃度X(mg/mL)為橫坐標，得到標準曲線的回歸方程為Y=13.8436X+0.00015，r2=0.9999。

1.2.3 桔梗莖葉總黃酮的提取

(1)桔梗莖葉樣品預處理：將過篩的桔梗莖葉藥材粉末用石油醚超聲提取30 min,棄去石油醚，濾渣揮干石油醚，干燥后冷卻備用。

(2)桔梗莖葉酶解-超聲偶聯法總黃酮的提取：準確稱取桔梗莖葉粉2.0g，置于125mL 具塞錐形瓶中，加入一定量的纖維素酶和一定料液比及一定體積分數的乙醇溶液，用酸度計調節溶液pH 值均為5.0[5-6]，在恒溫水浴鍋中以一定溫度、時間條件下酶解，15min 攪拌1次。待酶解完成后設置超聲波的相關條件，在一定的溫度和時間下超聲提取，抽濾，定容100 mL，得供試品提取液。

(3)桔梗莖葉總黃酮的測定：準確吸取1mL 供試品提取液于10mL 比色試管，按1.2.2標準曲線繪制項下顯色方法各取3份進行平行測定，記錄吸光度值，依據標準曲線，計算樣品中總黃酮的含量，并按下式計算總黃酮得率：

式中：C為總黃酮質量濃度(mg/mL)；n為提取液稀釋倍數；V為提取液的體積(mL)；m為桔梗莖葉的質量(g)。

(4)單因素試驗：分別考察纖維素酶用量：0.3%，0.6%，1.0%，2.0%，3.0%，酶解溫度：45，50，55，60，65℃；酶解時間：1h，1.5h，2h，2.5h，3h；料液比：1:10g/mL，1:15g/mL，1:20g/mL，1:25g/mL，1:30g/mL；乙醇溶液體積分數：40%，50%，60%，70%，80%；超聲溫度：40℃，50℃，60℃，70℃，80℃；提取時間：20min，30min，40min，50min，60min。按1.2.3.2下提取方法，分別進行單因素試驗。考察各因素對桔梗莖葉中總黃酮得率的影響。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 酶用量對總黃酮得率的影響

由圖1可以看出，由于纖維素酶能破壞細胞壁，有助于總黃酮的溶出，隨著纖維素酶用量的增加，總黃酮得率逐漸升高，在酶用量為0.6 %時有最大得率，但隨著酶用量的增加，過多的酶由于黏附作用，阻塞黃酮的溶出通道，使總黃酮得率呈下降趨勢。故較適宜纖維素酶用量為0.6%。

圖1 酶用量對總黃酮得率的影響

2.1.2 酶解溫度對總黃酮得率的影響

由圖2中可知，總黃酮得率隨溫度升高而增加，當溫度55℃時，總黃酮得率達到最高值；繼續升溫，由于過高的溫度會破壞纖維素酶的活性使總黃酮的得率降低，還可能導致黃酮類化合物部分分解，從而降低總黃酮得率[7-8]。 因此，適宜的酶解溫度為55℃。

圖2 酶解溫度對總黃酮得率的影響

2.1.3 酶解時間對總黃酮得率的影響

由圖3中可知，隨著酶解時間的增加，總黃酮得率逐漸升高，當酶解時間為1.5h 時，總黃酮得率達到最大，隨著酶解時間的增加得率降低。因此，適宜的酶解時間為1.5h。

圖3 酶解時間對總黃酮得率的影響

2.1.4 料液比對總黃酮得率的影響

由圖4可知，隨著料液比增大桔梗莖葉總黃酮得率增高，當料液比為1:20時總黃酮得率最大，之后料液比越大總黃酮得率呈降低的趨勢。因此，料液比1:20為佳。

圖4 料液比對總黃酮得率的影響

2.1.5 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

乙醇溶液體積分數不同，極性不同。由圖5可知，總黃酮得率隨著乙醇溶液體積分數的是先增加后減少，故乙醇體積分數為60%較適宜。

圖5 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

2.1.6 超聲溫度對總黃酮得率的影響

由圖6可知，隨著超聲提取溫度的升高，總黃酮的得率呈增加趨勢，溫度超過50℃以后，總黃酮得率有所下降，故取50 ℃為最佳超聲溫度。

圖6 超聲溫度對總黃酮得率的影響

2.1.7 超聲時間對總黃酮得率的影響

由圖7可知，總黃酮得率隨超聲時間延長而逐漸升高，40min后變化趨于平緩，從節能省時的角度考慮，選取超聲時間40min較適宜。

圖7 超聲時間對總黃酮得率的影響

2.2 正交試驗及結果

2.2.1 正交試驗設計

根據單因素實驗結果進行綜合分析，選取酶用量、酶解時間、酶解溫度、料液比因素，以桔梗莖葉中總黃酮得率為指標，進行L9(34)的正交試驗。正交試驗因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

表1 L9(34)正交試驗因素水平

表2 正交試驗結果

2.2.2 正交試驗結果分析

由表2的極差分析可知，各因素對桔梗莖葉中總黃酮得率的影響主次順序為：酶用量＞酶解溫度＞料液比＞酶解時間。故酶法-超聲偶聯提取桔梗莖葉總黃酮的最佳工藝條件為A2B2C2D2，即酶用量0.6%，酶解溫度55℃，料液比1:20，酶解時間1.5h。按最佳提取工藝條件驗證試驗結果見表3。

表3 驗證試驗結果

3 結語

本研究采用纖維素酶聯合超聲提取桔梗莖葉中總黃酮，通過單因素和正交試驗分析，在超聲溫度50℃、超聲時間40min、乙醇體積分數為60%的條件下，得出最佳的提取工藝為：酶用量0.6%，酶解溫度55℃，料液比l:20，酶解時間1.5h。在此提取工藝條件得到桔梗莖葉總黃酮得率為6.35 %。酶法-超聲偶聯提取桔梗莖葉總黃酮的工藝是一種新型提取方法，其操作簡單、快速、提取率高，可為桔梗莖葉中黃酮類化合物的提取研究提供技術參考，為桔梗非藥用部位資源的充分利用提供依據。