普洱茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)微生物的群落結(jié)構(gòu)分析

王橋美， 彭文書，楊瑞娟，趙苗苗，蔣勛，張軍，王興華*，嚴(yán)亮*

1(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明，650201)2 (普洱茶研究院，云南 普洱，665000)3(普洱市茶葉科學(xué)研究所，云南 普洱，665000) 4(滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 普洱茶學(xué)院，云南 普洱，665000)5(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650201)

普洱茶產(chǎn)于我國云南地區(qū)，以云南大葉種[Camelliasinesis(Linn.) var.assamiea(Mastters) Kitmaura)曬青毛茶為原料，是經(jīng)過渥堆發(fā)酵，在水分、溫度、微生物作用等綜合因素影響下形成的產(chǎn)品[1-2]。渥堆發(fā)酵過程中，許多微生物具有強(qiáng)大的降解多糖物質(zhì)成分的能力[3]，使得茶葉產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)反應(yīng)，形成香甜醇厚的獨(dú)特風(fēng)味[4-7]。可見微生物對普洱茶的品質(zhì)有著決定性作用[8]。

普洱茶發(fā)酵微生物的研究歷史是從20世紀(jì)80年代開始的，劉勤晉等[9]采用傳統(tǒng)分離，形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定法證實(shí)了細(xì)菌、酵母、霉菌和放線菌都參與了普洱茶的發(fā)酵。21世紀(jì)后，隨著聚合物鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分子生物學(xué)技術(shù)的興起，周紅杰等[10]和趙龍飛等[11]先后從發(fā)酵普洱茶中分離到了黑曲霉、酵母菌、米曲霉、根霉、灰綠曲霉和極少的細(xì)菌。楊瑞娟等[12]從渥堆發(fā)酵普洱茶中分離到大量嗜熱細(xì)菌和放線菌。李雪玲等[13]研究了普洱茶傳統(tǒng)渥堆發(fā)酵與發(fā)酵罐發(fā)酵中的微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明發(fā)酵罐發(fā)酵過程中的微生物多樣性顯著低于渥堆發(fā)酵。這些結(jié)果說明渥堆發(fā)酵中的微生物豐富多樣，受各種條件影響。

本研究利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)對普洱茶各發(fā)酵階段茶樣(JC)、發(fā)酵室空間空氣(KQ)、地面(DM)、茶原料(SC)的可培養(yǎng)微生物進(jìn)行跟蹤分離培養(yǎng)鑒定，并對純培養(yǎng)菌種進(jìn)行保存，建立普洱茶自然發(fā)酵菌種庫，以期探明普洱茶渥堆發(fā)酵各階段的優(yōu)勢微生物群落及其來源，為傳統(tǒng)發(fā)酵工藝改進(jìn)、人工接種發(fā)酵普洱茶、開發(fā)普洱茶新產(chǎn)品提供菌種資源和理論保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用樣品均采自普洱市茶葉科學(xué)研究所。LB、YEPD 和PDA培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Taq聚合酶(TAKARA, 大連)、KOD酶(TOYOBO，日本)、引物(ITS1F，ITS4；F27，R1492；NL1F，LS2R)，華大基因。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-150-Ⅰ型恒溫培養(yǎng)箱，上海—恒科學(xué)儀器有限公司；JN-400i無菌均質(zhì)器，寧波江南儀器廠；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YNGENE GBOX凝膠成像系統(tǒng)，北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司；茶樣取樣器，北京化工大學(xué)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溫濕度測定

在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中，用探針式溫濕度檢測器插入距茶堆邊緣1 m內(nèi)的5個點(diǎn)的堆心處，持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵過程中的溫濕度變化，在每次取樣時讀取溫濕度檢測器的數(shù)值，并測定茶樣水分含量。

1.3.2 茶樣采集

分別在發(fā)酵0、7、14、21，28、35、42 d時取發(fā)酵茶樣進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)，同時采集茶原料(SC)、潮水樣(即渥堆發(fā)酵前加入30%水的茶原料)、發(fā)酵室空氣(KQ)、地面(DM)樣品進(jìn)行微生物的分離培養(yǎng)。

1.3.3 樣品中微生物的分離培養(yǎng)及鑒定

微生物培養(yǎng)[14]：取10 g茶樣，加入90 mL無菌水，均質(zhì)器中拍打3 min，取上清液稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個濃度梯度，將10-3、10-4、10-5濃度的液體100 μL涂布到PDA、YEPD和LB培養(yǎng)基中上，放入25、37、50、60 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待菌落長出后挑取單菌落劃線培養(yǎng)，得單菌落用于菌種保存及鑒定。

菌種鑒定[15-16]：將純化的菌株制成菌懸液，加入以下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 體系(50 μL)：10×Taq buffer 5 μL，2 mm dNTP mixture 5 μL，Taq酶(5.0 U/μL)1 μL，上游引物(10 μmol/L) 2 μL，下游引物(10 μmol/L)2 μL，菌懸液2 μL，水33 μL。真菌引物：上游引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) 1 μL，下游引物ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)1 μL；細(xì)菌引物：上游引物F27(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)1 μL，下游引物R1492(TACGGYTACCTTGTTACGACTT) 1 μL。PCR反應(yīng)條件：(1)預(yù)變性 94 ℃ 5 min；(2)變性96 ℃ 10 s；(3)復(fù)性(退火)50 ℃ 30 s；(4)延伸72 ℃ 2 min；步驟(2)～(4)循環(huán)35次；(5)72 ℃延伸10 min；(6) 4 ℃保溫。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州華大基因測序，根據(jù)測序結(jié)果，用菌株的16S rRNA和ITS基因作為靶序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中用BLAST程序搜索同源序列，挑選與靶系列最相近的參考菌株系列，查出相應(yīng)微生物，完成菌種鑒定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

將靶系列與NCBI中的已知序列進(jìn)行比對，挑選與靶序列相似度最高的已知序列，用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用Cytoscape-v3.6.1軟件對發(fā)酵0、7、14、21、28、35和42 d茶樣中可培養(yǎng)微生物的異同進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，同時對SC、JC、KQ和DM中的可培養(yǎng)微生物的異同進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶發(fā)酵過程中的堆溫、濕度、水分含量變化趨勢

溫度、濕度及水分含量的變化趨勢如圖1所示。溫度曲線圖顯示，發(fā)酵0～7 d堆心溫度上升較快，第28天溫度達(dá)到最高值57.1 ℃，而后開始緩慢下降。溫度的這一變化趨勢可能與微生物大量繁殖有關(guān)。何國藩等[17]的研究表明微生物代謝釋放大量熱量，使堆內(nèi)溫度急劇升高，通過翻堆，使溫度產(chǎn)生變化，這種溫度變化為微生物生長(35 ℃)和酶促反應(yīng)(60 ℃)提供合適的條件[18]。溫瓊英等[19]的研究再次證明微生物新陳代謝釋放的呼吸熱是濕熱作用的熱源。含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢圖顯示，從0 d的34.3%到42 d的16.4%，隨著發(fā)酵的進(jìn)程，茶葉水分含量緩慢下降。這與發(fā)酵過程中微生物代謝及酶促化學(xué)反應(yīng)對水分的消耗有關(guān)。在整個發(fā)酵過程中濕度變化曲線平穩(wěn)，從0～35 d保持在96%～99.6%，42 d時，濕度降至87%，這與茶葉水分含量減少呈正相關(guān)。

圖1 普洱茶發(fā)酵過程中堆溫、茶樣水分含量和濕度的變化情況Fig.1 The temperature, moisture content and humidity of Pu-erh tea during fermentation

2.2 普洱茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)優(yōu)勢微生物的分離鑒定

分離到可培養(yǎng)細(xì)菌49株，去重后鑒定為14種，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，菌株的分類信息如表1所示。14種細(xì)菌分屬于Firmicutes(Bacillussp.、Geobacillussp.、Brevibacillussp.、Paenibacillussp.)和Actinobacteria(Isoptericolasp.、Corynebacteriumsp.、Kocuriasp.、Streptomycessp.、Brachybacteriumsp.)。其中Bacillussp.的種類最多。Bacillussubtilis、Bacillusthermoamylovorans、Streptomycesrecifensis為嗜熱細(xì)菌[20]，能在60 ℃的發(fā)酵高溫存活。Corynebacteriumsp.和Streptomycessp.在以往研究中未見報道，此外，還分離到1株疑似新種，正在做新種鑒定。據(jù)前人報道[21-23]，參與普洱茶發(fā)酵的微生物還有Lactobacillussp.、Staphylococcussp.和Microbacteriumsp.，本研究中沒有分離到，可能是所選培養(yǎng)基不適合這些微生物生長，也可能與發(fā)酵條件不同有關(guān)。

圖2 細(xì)菌16S rRNA基因的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA gene注：分枝結(jié)點(diǎn)數(shù)值表示1 000次Bootstrap分析所支持的次數(shù)，比例尺(0.01)表示序列差異的分枝長度(圖3同)

分離到可培養(yǎng)真菌45株，去重后鑒定為12種，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，菌株的分類地位信息見表1。12種菌株分屬于Ascomycota(Aspergillussp.、Candidasp.、Thermomycessp.、Blastobotryssp.)、Mucoromycota(Rhizomucorsp.)和Basidiomycota(Sporidiobolussp.)。其中Aspergillussp.的種類較多。Rhizomucorpusilus能在50 ℃條件下生長，屬于嗜熱真菌[12, 24]。Aspergillusruber和Aspergilluscarbonarius在之前的研究中未見報道[12, 13, 16, 20, 22-26]。酵母Candidasp.、Arxulasp.和Sporidiobolussp.主要從發(fā)酵后期的茶樣中獲得。

2.3 不同發(fā)酵階段茶樣中可培養(yǎng)微生物的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

不同發(fā)酵階段的微生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系如圖4所示，Aspergillustamarii、Kocuriaturfanensis、Rhodosporidiobolusruineniae和Paenibacillusbarengoltzii只在SC中分離到，Aspergillusniger和Rhizomucorpusillus在所有階段都分離到。7、14、21 d樣品中分離的微生物種類較少，曲霉屬的微生物種類最多。從28、35、42 d樣品中分離的微生物種類較多，主要為細(xì)菌和酵母菌，且微生物種類相似。

圖3 真菌ITS基因的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The neighbor-joining phylogenetic tree of ITS genes

圖4 不同發(fā)酵階段茶樣中微生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.4 The network of culturable microorganisms in different fermentation stages注：SC代表茶原料，7、14、21、28、35和42 d分別代表發(fā)酵第7、14、21、28、35、42天的茶樣

2.4 茶樣與發(fā)酵環(huán)境中的微生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

從發(fā)酵環(huán)境中分離的微生物種類如表2所示。在發(fā)酵室空氣(KQ)中分離到35株，去重后鑒定為15種，真菌9種，細(xì)菌6種。發(fā)酵室地面(DM)分離到15株，鑒定為8種,真菌3種，細(xì)菌5種。茶樣與發(fā)酵環(huán)境中的微生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系如圖5所示。JC中分離的微生物種類最多，KQ次之，DM最少。Aspergillusniger和Bacillusoleronius是KQ、SC、DM和JC共有種類。Rhodosporidiobolusruineniae、Paenibacillusbarengoltzii、Aspergillustamarii和Rhizomucorpusillus是JC和SC共有的種類。Aspergillusfumigatus是JC與KQ共有的種類。Bacillussubtilis是JC和DM共有的種類。

表1 普洱茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)微生物的分類地位Table 1 Taxonomic status of cultureable microbes during the fermentation of Pu-erh tea

3 討論

從發(fā)酵不同階段的樣品中分離到真菌45株，6個屬，12種，Aspergillussp.的種類較多，細(xì)菌49株，9個屬，14種，Bacillussp.的種類較多。Aspergillusniger和Bacillusoleronius存在于所有樣品中。發(fā)酵茶樣與茶原料的可培養(yǎng)微生物相似性較大，與環(huán)境中的微生物相似性較小，初步推測發(fā)酵中的大部分微生物可能來自于茶原料。結(jié)果分析顯示，發(fā)酵7 d左右，喜溫喜濕的黑曲霉增加迅速，成為發(fā)酵前期的主要微生物。隨著水分含量降低，黑曲霉的數(shù)量在中后期逐漸衰減。白飛榮等[25]研究表明，Aspergillussp.代謝能產(chǎn)生有機(jī)酸及多酚氧化酶、纖維素酶、單寧酶等，可促進(jìn)茶葉粗纖維組織的軟化和大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化。黃振興等[27]的研究表明Aspergillusniger進(jìn)行糖代謝能分解大量的多糖，并產(chǎn)生大量的單糖，為后期酵母和細(xì)菌的滋生提供大量的養(yǎng)分。因此Arxulaadeninivorans和Bacillusoleronius在發(fā)酵后期大量增加。楊曉蘋等[23]發(fā)現(xiàn)Arxulaadeninivorans能分泌大量胞外酶，在高溫條件下表現(xiàn)出高活力，可促進(jìn)茶葉中多酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，形成香醇濃厚的滋味物質(zhì)，是普洱茶特殊風(fēng)味形成的關(guān)鍵菌群。MOHAMMAD等[28]的研究表明，發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌Bacillussp.能產(chǎn)生豐富的多酚氧化酶和過氧化物酶，其分泌的多酚氧化酶能夠?qū)ⅫS烷醇類及其糖苷類底物轉(zhuǎn)化為如雙黃烷醇、茶黃素、茶紅素等物質(zhì)，在茶葉風(fēng)味和成色的形成中起著重要作用，有利于提高普洱茶品質(zhì)及縮短發(fā)酵時間。此外，有文章[3]曾報道，本文分離到的嗜熱菌Bacillussubtilis、Bacillusthermoamylovorans、Streptomycesrecifensis等能分泌蛋白酶、脂肪酶、果膠酶等多種胞外酶，可能在普洱茶品質(zhì)形成的中過程起著重要的作用。

表2 普洱茶發(fā)酵環(huán)境中可培養(yǎng)微生物的分類地位Table 2 Taxonomic status of cultureable microbes in fermentation environment of Pu-erh tea

SC-茶原料；KQ-發(fā)酵空氣；DM-發(fā)酵地面；JC-發(fā)酵茶樣圖5 發(fā)酵茶樣與發(fā)酵環(huán)境中可培養(yǎng)微生物類群異同網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 The similarities and differences network of culturable microbial groups between fermenting tea samples and fermentation environment

普洱茶發(fā)酵過程中，大量的微生物參與了物質(zhì)轉(zhuǎn)化，對這些微生物在普洱茶自然發(fā)酵過程中的功能研究是發(fā)酵工藝改進(jìn)的前提條件。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及菌種保存可建立普洱茶自然發(fā)酵菌種庫，為人工接種發(fā)酵普洱茶工藝研究和優(yōu)勢菌再發(fā)酵中的功能研究提供菌種資源保障。