阿拉伯半乳聚糖吸附阿魏酸的特性研究

朱建飛,唐敏,高瑞萍,2,常海軍,2

1(重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶, 400067)2(重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲(chǔ)運(yùn)工程技術(shù)研究中心，重慶, 400067)

近年來(lái)，有關(guān)生物大分子與小分子相互作用的研究報(bào)道越來(lái)越多，特別是關(guān)于蛋白質(zhì)(包括酶)和DNA與活性小分子相互作用的研究逐漸成熟[1-3]。但是關(guān)于多糖與活性小分子相互作用的研究?jī)?nèi)容卻不多。阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan, AG)是阿拉伯糖和半乳糖組成的中性多糖，在醫(yī)藥、食品、化妝品中應(yīng)用廣泛。美國(guó)食品藥品管理局已經(jīng)批準(zhǔn)AG可以作為食品添加劑使用。AG的吸水性很強(qiáng)，添加到食品中可以形成一種膠凝體，增加食品的體積，改善食品的軟度和口感[4]。阿魏酸(ferulic acid, FA)是酚酸的一種，廣泛存在于植物中，是阿魏、當(dāng)歸、川芎、升麻等中藥材的有效成分，在醫(yī)藥、化妝品、保健品、食品中有著廣泛的應(yīng)用[5-7]。由于FA不穩(wěn)定，它的許多應(yīng)用都會(huì)被限制，通常，F(xiàn)A與多糖結(jié)合后可以形成更加穩(wěn)定、更具有靶向活性的復(fù)合物，常見(jiàn)于植物細(xì)胞壁、烘焙食品、啤酒加工等[8-9]。目前，還未見(jiàn)有AG與FA結(jié)合特性研究的文獻(xiàn)報(bào)道。本文旨在研究AG與FA結(jié)合特性，為該復(fù)合物在食品、藥品等方面應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

阿魏酸(純度99%),湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司；阿拉伯半乳聚糖(純度>98%),上海伊卡生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、甲醇(分析純)，成都科龍化工試劑廠；甲酸、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)(分析純)，重慶川東化工有限公司；CP214型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；DELTA320-S型PH計(jì)，深圳富哲儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；T-18型分散機(jī)(配S10N 5G型分散頭)，德國(guó)IKA公司；UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；傅立葉變換紅外光譜儀，日本Shimadzu公司；HJ-6A型多頭磁力攪拌器，金壇市科析儀器有限公司；XH-B型漩渦混合器，上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司；KS-080型超聲波清洗機(jī)，深圳市潔康洗凈電器有限公司；LGJ-18S型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；MD34型透析袋，北京索萊寶科技有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 FA含量測(cè)定

首先采用紫外掃描分析法，于200～400 nm波長(zhǎng)內(nèi)對(duì)FA的甲醇溶液進(jìn)行掃描，以確定FA的特征吸收波長(zhǎng)。精確稱(chēng)取2.5 mg FA標(biāo)品，用甲醇溶解并定容至25 mL，制成100 μg/mL的母液，再分別取該溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分別定容至25 mL，搖勻。制成的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為2、4、6、8、12、16 μg/mL。采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法檢測(cè)FA的含量[6]，流動(dòng)相：A相： 0.3%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液；B相：0.3%(體積分?jǐn)?shù))甲酸甲醇溶液，A相與B相體積比為60∶40，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)322 nm，出峰時(shí)間8.1 min。將配制好的梯度FA甲醇溶液按照上述方法測(cè)量，記錄所得的峰面積，以FA濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得到阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=77.276X-13.512，R2=0.999 1，式中X為FA濃度，Y為峰面積。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 平衡透析試驗(yàn)

取長(zhǎng)約10 cm的透析袋，用前進(jìn)行常規(guī)處理，取6 mL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的AG溶液和2 mL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的FA溶液，放入透析袋中，封好透析袋，將透析袋放入盛有100 mL磷酸緩沖液的燒杯中，將燒杯放在磁力攪拌器上攪拌，每隔1 h用紫外分光光度計(jì)測(cè)1次透析外液中FA的吸光度，直至吸光度不變時(shí)達(dá)到透析平衡,以確定吸附時(shí)間。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

考察單因素有緩沖液pH、溫度和FA濃度。選取的點(diǎn)分別為緩沖液pH:3、4、5、6、7；溫度：20、30、40、50、60 ℃；FA質(zhì)量濃度：1、5、9、13、17 mg/mL。分別將盛有6 mL 0.5 mg/mL AG和2 mL不同濃度的FA溶液的透析袋放入盛有 100 mL不同pH濃度為0.5 mol/L的PBS緩沖液中，透析溫度為20～60 ℃，透析平衡后透析袋外液過(guò)0.45 μm濾膜后經(jīng)HPLC測(cè)定游離FA含量。每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)FA的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AG對(duì)FA的吸附量(Qe，μg/mg)。

1.3.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)。選取溫度、pH和FA濃度3個(gè)因素為自變量(X)，各分3個(gè)水平，共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，可以分為兩類(lèi)，一類(lèi)是析因點(diǎn)，自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn)；另一類(lèi)是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用以評(píng)估試驗(yàn)的誤差。以AG對(duì)FA的吸附量(Qe)為響應(yīng)值(Y)，運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，通過(guò)響應(yīng)面分析對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平取值及編碼表見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素和水平Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design

1.3.4 AG - FA復(fù)合物的制備

取60 mL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的AG溶液和20 mL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的FA溶液于透析袋中，將透析袋放入盛有100 mL的磷酸緩沖液的燒杯中透析一定時(shí)間，透析平衡時(shí)取出透析袋，流水透析24 h，去除大部分雜質(zhì)，再用蒸餾水透析，每2～3 h更換1次蒸餾水，去除小分子雜質(zhì)。將透析袋內(nèi)液取出，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后大大降低透析液的體積，冷凍干燥，制成樣品，密封后置于干燥器中保存。

1.3.5 AG-FA復(fù)合物結(jié)構(gòu)表征

(1)紫外分光光譜分析

分別把FA、AG、復(fù)合物、物理混合物配成質(zhì)量濃度同為1 mg/mL的溶液，然后用紫外分光光度計(jì)在200～350 nm的波長(zhǎng)下掃描得到紫外圖譜。

(2)傅里葉變換紅外光譜分析

分別精確稱(chēng)取2 mg樣品，樣品分別為FA、AG、復(fù)合物、FA和AG質(zhì)量比為1∶4的物理混合物，其中物理混合物為采用漩渦混合器處理1 min制得。樣品與干燥的KBr以質(zhì)量比1∶50的比例混合在瑪瑙研缽研磨成均勻細(xì)粉，采用專(zhuān)用的壓片設(shè)備，制備成薄片[10]。然后分別用傅立葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行紅外掃描。

(3)掃描電子顯微鏡分析

掃描電鏡法是用導(dǎo)電雙面膠將樣品粉末固定在金屬樣品平臺(tái)上，在真空中噴涂鉑金后，置于掃描電子顯微鏡中以 3 kV 電子束觀察，拍攝有代表性的樣品顆粒的形貌照片[11]。樣品分別是AG、復(fù)合物和物理混合物，拍攝的照片放大倍數(shù)是500和2 000倍放大倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 平衡透析實(shí)驗(yàn)時(shí)間的確定

以透析外液中游離FA的吸光值為縱坐標(biāo)，吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)，做出AG對(duì)FA的吸附曲線，如圖1所示，隨著時(shí)間的增大，游離FA的濃度逐漸增大，當(dāng)達(dá)到5 h時(shí)，F(xiàn)A濃度不再增大，表明AG對(duì)FA的吸附在5 h時(shí)達(dá)到最大。故以下實(shí)驗(yàn)采用5 h的吸附時(shí)間。

圖1 時(shí)間對(duì)透析外液中游離FA濃度的影響Fig.1 Effect of time on the concentration of free FA in dialysate注：標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 pH對(duì)吸附量的影響

pH是影響吸附過(guò)程的重要影響因素之一。它與吸附劑表面的吸附機(jī)制有關(guān)，并且反映了吸附劑與吸附之間理化作用的本質(zhì)[12]。本實(shí)驗(yàn)中FA質(zhì)量濃度設(shè)定為0.5 mg/mL，溫度為25 ℃，pH為3～7，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。隨著pH增大，AG對(duì)FA的吸附量顯著增大，當(dāng)pH為5時(shí)，達(dá)到最大吸附量，為81.62 μg/mg。當(dāng)pH再增大時(shí)，吸附量則減小。吸附量隨透析外液pH波動(dòng)的現(xiàn)象可能是由于阿魏酸是弱有機(jī)酸，在水溶液中易受溶液pH值影響而發(fā)生變性、異構(gòu)化、產(chǎn)生沉淀等。

圖2 透析外液pH對(duì)吸附量的影響Fig.2 Effect of pH of dialysate on the adsorption capacity of FA on AG

2.1.3 溫度對(duì)吸附量的影響

根據(jù)pH對(duì)吸附量的影響結(jié)果，將緩沖液的pH設(shè)定為5，F(xiàn)A質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，溫度設(shè)定為20～70 ℃。圖3表明了不同溫度對(duì)AG對(duì)FA吸附的影響結(jié)果。由圖3可知，當(dāng)溫度<50 ℃時(shí)，吸附量隨著溫度變化趨勢(shì)不明顯，呈現(xiàn)先增大后減小再增大的趨勢(shì)，吸附量都在125.60 μg/mg(40 ℃)左右。KAMMERER等[13]也報(bào)道了類(lèi)似的趨勢(shì)，他們認(rèn)為溫度(25、50 ℃)并沒(méi)有顯著影響顏料的結(jié)合能力。隨著溫度繼續(xù)升高，對(duì)FA的吸附量顯著降低，60 ℃時(shí)的吸附量為80.12 μg/mg。鑒于以上情況，最終選取40 ℃ 進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同溫度對(duì)吸附量的影響Fig.3 Effect of temperature on the adsorption capacity of FA on AG

2.1.4 FA濃度對(duì)吸附量的影響

吸附質(zhì)濃度對(duì)吸附過(guò)程影響很大，通常都用作影響吸附量的重要因素之一[14]。由圖4可知，當(dāng)溫度和緩沖液pH保持不變時(shí)，隨著FA濃度的增大，吸附量增加。低質(zhì)量濃度(<5 mg/mL)時(shí)吸附量增加幅度較小，高質(zhì)量濃度(>5 mg/mL)時(shí)吸附量陡增，當(dāng)FA質(zhì)量濃度增加到17 mg/mL時(shí)，吸附量達(dá)到極大值，且此時(shí)再增大FA濃度，透析時(shí)則容易出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象。結(jié)果表明FA濃度顯著影響AG吸附FA的效果。

圖4 FA濃度對(duì)吸附量的影響Fig.4 Effect of the concentration of FA on the adsorption capacity of FA on AG

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

以吸附量為響應(yīng)值(Y)，采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸擬合分析，得到如表2所示的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。擬合得到的理化因素與吸附量間的模型公式為：

式中:X1、X2和X3分別為FA質(zhì)量濃度(mg/mL)、緩沖液pH和溫度(℃)。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The results of central composite design

對(duì)響應(yīng)面模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3，模型達(dá)到顯著水平(P<0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，失擬值和純誤差值小，R2=0.913 3，說(shuō)明方程與實(shí)際情況擬合得較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此可以用該方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。方差分析還表明，一次項(xiàng)中有顯著影響因素，而二次項(xiàng)所有因素影響都不顯著，表明各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。其中FA濃度和溫度對(duì)吸附量有極顯著的影響，而pH對(duì)其影響則并不明顯。根據(jù)方差分析表中單因素的F值可看出，影響AG吸附FA的因素影響效果按大小排序依次為FA質(zhì)量濃度(X1)>溫度(X3)>pH(X2)。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance

a-FA質(zhì)量濃度 (X1)和pH(X2)及其相互作用；b-溫度(X3)和FA質(zhì)量濃度(X1)及其相互作用；c-溫度(X3)和pH(X2)及其相互作用圖5 FA濃度、pH、溫度及其相互作用對(duì)AG對(duì)FA的吸附能力影響Fig.5 The infuence of FA concentration，pH，temperature and their Interaction

圖5-a、圖5-b、圖5-c分別表示FA質(zhì)量濃度、pH和溫度及其相互作用對(duì)AG對(duì)FA的吸附能力影響的響應(yīng)面。可以看出FA濃度、pH和溫度間的交互作用不顯著，其中FA濃度對(duì)吸附量的影響最為顯著。根據(jù)Design Expert 8.0軟件最終擬合出的最優(yōu)吸附條件為FA質(zhì)量濃度15 mg/mL，pH 5.03，溫度20 ℃，計(jì)算出的理論吸附量是1 374.25 μg/mg。在優(yōu)化后工藝的條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)際吸附量為1 370.17 μg/mg，與模型理論預(yù)測(cè)值較為接近，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型比較可靠。

2.3 樣品結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紫外圖譜分析

由圖6可知，F(xiàn)A溶液的圖譜中有3個(gè)大的吸收峰，215.5 nm(λ1，芳香環(huán)的雙鍵吸收，π-π* 躍遷產(chǎn)生)，289.5 nm和312 nm(λ2，λ3含n電子的不飽和基團(tuán)的吸收，n-π* 躍遷產(chǎn)生)[15]，但是與復(fù)合物的圖譜對(duì)比，復(fù)合物的這幾個(gè)吸收峰都沒(méi)有，雖然AG和復(fù)合物在190～350 nm處沒(méi)有明顯的吸收峰，但是它們濃度相同時(shí)吸光度不同，復(fù)合物與物理混合物的圖譜也明顯不同，所以初步判斷AG與FA形成了復(fù)合物。

a-FA;b-物理混合物;c-AG;d-復(fù)合物圖6 紫外光譜圖Fig.6 Ultraviolet spectrogram of samples注：λ1=215.5 nm, λ2 =289.5 nm, λ3=312 nm

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析

如圖7所示，AG在3 400 cm-1左右的寬峰是O—H的伸縮振動(dòng)，是多糖的特征吸收峰[16]，2 924 cm-1處的峰是—CH2的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰。圖7中的c為FA的FT-IR圖譜，與黃自知等[17]的報(bào)道完全吻合。比較圖7的b和d可見(jiàn)，AG、FA的化學(xué)復(fù)合物與其物理混合物的FT-IR圖譜有明顯差異。圖7中的d中物理混合物的圖譜保留了FA的特征吸收峰，而圖7中的b中復(fù)合物的很多FA的特征吸收峰消失，推測(cè)是由于AG對(duì)FA的非共價(jià)吸附作用所致。類(lèi)似的結(jié)果在ZHANG等[5]關(guān)于菜籽果膠類(lèi)多糖與阿魏酸非共價(jià)相互作用的研究中有報(bào)道。

a-AG;b-復(fù)合物;c-FA;d- 物理混合物圖7 紅外光譜圖Fig.7 FT-IR spectrogram of samples

2.4 掃描電子顯微鏡結(jié)果分析

由圖8明顯可以看出未結(jié)合FA的AG顆粒表面比較光滑且體積較大，物理混合物中FA晶體與AG呈分離狀態(tài)，F(xiàn)A與AG之間未結(jié)合；而AG與FA復(fù)合物表面粗糙，F(xiàn)A晶體嵌入AG內(nèi)，結(jié)合比較緊密，未見(jiàn)有游離狀態(tài)的FA晶體,且復(fù)合物的顆粒較結(jié)合之前的AG小，表明AG與FA結(jié)合形成了新物質(zhì)，形貌特征發(fā)生了變化。

a-AG(放大500倍);b-AG(放大2 000倍);c-復(fù)合物(放大500倍);d-復(fù)合物(放大2 000倍);e-物理混合物(放大500倍);f-物理混合物(放大2 000倍)圖8 樣品的掃描電子顯微鏡圖Fig.8 Scanning electron microscope of samples

3 結(jié)論

(1)通過(guò)平衡透析實(shí)驗(yàn)對(duì)影響AG吸附FA效果在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Benhnken 設(shè)計(jì)并進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各因素對(duì)吸附影響效果的大小順序?yàn)镕A質(zhì)量濃度>pH>溫度，優(yōu)化出AG吸附FA的條件：FA質(zhì)量濃度15 mg/mL、pH 5.03、溫度20 ℃。在此條件下，AG吸附FA的實(shí)際值為1 370.17 μg/mg。

(2)紫外和紅外掃描圖表明AG與FA產(chǎn)生了結(jié)合作用，生成了新的復(fù)合物。掃描電子顯微鏡掃描圖顯示，與各單體、物理混合物相比，AG-FA的形貌特征發(fā)生了改變。

(3)本研究證實(shí)AG與FA結(jié)合產(chǎn)生了新物質(zhì)，但兩者之間結(jié)合的分子間作用力，復(fù)合物的高級(jí)結(jié)構(gòu)和溶液性質(zhì)還需進(jìn)一步研究。