山區型和田羊毛囊KAP1.1基因表達載體構建及生物信息學分析

余路菲 趙 軍 李樹偉*

（1塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

毛囊作為真皮的衍生物，是一個結構和功能非常復雜的亞器官［1］，是皮膚的主要附屬器之一，具有高度自我更新能力，是機體內獨特的可再生器官，毛囊細胞經增殖分化最終形成毛發。羊毛和絨纖維的主要成分是角蛋白，同時角蛋白是構成毛纖維的骨架［2］，毛纖維角蛋白中間絲蛋白（keratin intermediate filament protein，KIF）和角蛋白關聯蛋白（keratin-associated protein，KAP）占羊毛纖維的90%［2］，具有高度的規律化組織結構［3-4］。角蛋白關聯蛋白是組成羊毛纖維的主要結構蛋白之一［5］，根據其蛋白質序列中的氨基酸含量，主要分為三大類型［6］。其中，高硫（high sulphur，HS）蛋白則為角蛋白關聯蛋白超家族中的一個類型，包括KAP1、KAP2和KAP3三個家族，且大小約為151-181個氨基酸，Cys含量約為22%。據研究，角蛋白對毛纖維的理化性質（細度、長度、密度、顏色和光澤、氨基酸含量等）具有一定影響［7］。由于KAP是編碼毛囊毛纖維結構蛋白的主要基因，因此，探索其對綿羊羊毛性狀遺傳變異的影響,對利用該基因改善羊毛密度、毛纖維直徑、長度等品質性狀有著非常重要的意義。

近年來，隨著分子生物學、基因工程等技術的不斷提升，對綿羊羊毛性狀和品質的研究吸引了越來越多專家學者。利用基因技術探究角蛋白關聯蛋白對羊毛纖維品質的影響，發現羊毛的角蛋白組成與羊毛纖維結構有著密切關系［8］，由于遺傳、生理、生活環境等因素，導致不同地區品種綿羊羊毛品質有較明顯差異。朱建勛［9］在KAP11-1對5個中國綿羊群體的遺傳變異的影響研究中，認為KAP11-1基因作為羊毛經濟性狀的主要候選基因之一,其核苷酸序列的變異導致其相應氨基酸的改變,最終可能會影響羊毛纖維的結構；徐從祥等［10］研究KAP6.1基因的多態性及其與羊毛性狀的相關性，發現KAP6.1基因可作為綿羊污毛產量的候選基因之一,其中BB基因型可作為分子標記用于選擇污毛產量高的個體；依明·蘇來曼［11］研究了和田羊KAP7、KAP8基因遺傳多樣性及其與羊毛長度的關聯性分析，其結果顯示和田羊KAP8基因沒有發現多態性，KAP7基因具有多態性,關聯分析表明,和田羊不同基因型之間羊毛長度差異顯著；劉曉軍等［12］用綿羊KAP2基因對影響羊毛性狀的表型差異進行了研究，推測出KAP2基因可能是影響羊毛性狀的差異基因；李志剛等［13］用山區型和田羊毛囊KAP6.1、KAP7與KAP8基因進行克隆分析，成功在原核細胞中表達對山區型和田羊毛囊HGT蛋白3個家族的主要基因；武振輝等［14］探究了毛囊KIF2.9基因對半粗毛型地方品種綿羊羊毛品質和性狀的影響，成功克隆出山區型和田羊毛囊KIF2.9基因；高建軍等［15］研究了綿羊毛囊角蛋白基因對異質毛綿羊羊毛性狀、品質的影響，并成功構建了和田羊毛囊角蛋白原核表達載體。

綜上所述，盡管對于羊毛毛囊角蛋白關聯蛋白基因有一些研究，但對高硫蛋白家族中的KAP1.1基因在粗毛羊、半粗毛羊羊毛品質方面的影響研究較少，對新疆南疆山區型和田羊品種（系）的羊毛毛囊發育相關基因的報道更少。因此，本試驗對山區型和田羊毛囊KAP1.1基因進行克隆及其生物信息學分析，為進一步探討角蛋白基因對羊毛性狀的影響提供理論依據，對研究新疆南疆地方特色綿羊品種遺傳資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 和田羊毛囊樣品采集及組織保存

山區型和田羊來自新疆和田地區策勒縣恩尼里克鄉，于塔里木大學動物試驗站飼養。將綿羊皮膚局部麻醉，體側羊毛去除一部分，用直徑為1 cm的取樣器采集樣品,保存于液氮中備用，后期對綿羊進行護理以至痊愈，手術程序嚴格遵循動物倫理福利要求。

1.1.2 主要試劑與儀器

真核表達載體pEGFP-N1購于上海迪奧生物科技有限公司，T4DNA連接酶、限制性內切酶HindIII、PstI均為寶生物工程有限公司產品;SanPrep‘柱式’質粒DNA小提抽提試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；梯度PCR儀（Veriti）購自ABI公司；低速臺式離心機（TDL-80-2B）購自上海安亭科學儀器廠；凝膠分析系統（GELDOC 2000）購自Bio-Rad公司；Motic顯微鏡（CX21）購自上海團結儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

參照GenBank中的綿羊KAP1.1基因組序列（登錄號：HQ110109.1），利用DNAstar軟件設計引物，引物序列如下：F：5′-AAGCTTATGGCCTGCTGTTCC ACC-3′（下劃線為HindIII的酶切位點），R：5′-CTG CAGTCAGCAGGTGGGCTC-3′（下劃線為PstI的酶切位點）。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取及cDNA的合成

用Trizol法提取山區型和田羊皮膚組織總RNA，利用分光光度計檢測樣品濃度，參照反轉錄試劑盒說明書，以Oligo d（T）為引物，反轉錄獲得樣品的cDNA。

1.2.3 PCR擴增

以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系共20 μL：10×Ex PCR 緩沖液（無Mg2+）2.5 μL，25 mM MgCl23 μL，dNTP 1 μL，DMSO 0.3 μL，Ex Taq 酶 0.1 mL，Bio-H2O 11.9 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA模板0.2 μL。PCR反應條件為：94℃預變性11 min；94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃總延伸10 min。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.4 重組質粒pMD18-T-KAP1.1的構建與鑒定

將電泳檢測分析正確的綿羊毛囊KAP1.1基因用膠回收試劑盒回收目的片段連接pMD18-T載體，構建重組質粒pMD18-T-KAP1.1，將重組質轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37℃培養過夜，利用藍白斑挑選陽性菌，接種到氨芐抗性的LB液體培養基中，37℃恒溫培養，取菌液，按質粒提取試劑盒操作步驟提取質粒pMD18-T-KAP1.1。對重組質粒進行PCR鑒定及PstI、HindIII雙酶切鑒定，同時將鑒定正確的陽性菌送至公司進行測序。

1.2.5 重組質粒pEGFP-N1-KAP1.1的構建與鑒定

將pMD18-T-KAP1.1重組質粒和真核表達載體pEGFP-Nl分別用HindIII和PstI雙酶切，37℃恒溫水浴過夜，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結果并拍照保存。利用膠回收試劑盒回收KAP1.1基因目的片段和真核表達載體pEGFP-N1片段，將兩者用T4 DNA連接酶16℃金屬浴連接過夜，構建真核表達pEGFP-N1-KAP1.1重組質粒，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，37℃恒溫培養在含卡那抗性的LB固體培養基上并過夜，挑選陽性菌，接種到卡那抗性的LB液體培養基中，取菌液用質粒提取試劑盒提取真核表達重組質粒pEGFP-N1-KAP1.1，對真核表達重組質粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，將鑒定正確的陽性菌送至公司測序。

1.2.6 生物信息學分析

采用MEGA6.0軟件對KAP1.1基因序列進行分析；采用ProtParam在線軟件對KAP1.1基因編碼蛋白基本理化性質進行分析；采用SOPMA對KAP1.1蛋白進行二級結構預測；用ExPASy在線軟件中的TMpred對KAP1.1基因編碼蛋白跨膜區域及方向進行預測；利用ProtScate在線軟件對KAP1.1基因編碼蛋白親疏水性進行分析；利用MEGA6.0軟件對KAP1.1基因的同源性進行分析，并構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 和田羊毛囊KAP1.1基因PCR擴增結果

以山區型和田羊皮膚組織毛囊的cDNA為模板進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在519 bp處出現目的條帶（圖1），與預期片段大小一致。

圖1 山區型和田羊毛囊KAP1.1基因PCR擴增結果

2.2 重組質粒pMD18-T-KAP1.1的鑒定

對重組質粒pMD18-T-KAP1.1進行HindIII、PstI雙酶切鑒定，結果見圖2。由圖2可知，約在2 692 bp和519 bp處均出現目的條帶，與理論條帶大小相符，表明重組質粒pMD18-T-KAP1.1構建成功。

圖2 pMD18-T-KAP1.1克隆質粒雙酶切鑒定結果

2.3 真核表達重組質粒pEGFP-Nl-KAP1.1的鑒定

對重組質粒pEGFP-Nl-KAP1.1進行PCR和HindIII、PstI雙酶切鑒定，結果見圖3和圖4。由圖3可知，在約519 bp處出現目的條帶，與KAP1.1基因大小相符；由圖4可知，約在4 700 bp和519 bp處均出現目的條帶，與理論條帶大小相符。

圖3 pEGFP-Nl-KAP1.1真核表達重組質粒的PCR鑒定

圖4 pEGFP-Nl-KAP1.1真核表達重組質粒的雙酶切鑒定

2.4 毛囊KAP1.1基因序列比對及分析

2.4.1 核苷酸序列比對

對山區型和田羊毛囊KAP1.1基因序列與Gen-Bank中KAP1.1基因序列進行比對，結果表明，山區型和田羊毛囊KAP1.1基因與GenBank中的美利奴羊KAP1.1基因序列同源性可達98.65%。第38位堿基T變為C、第39位堿基C變為T、第42位堿基T變為C、第394位堿基T變為C、第441位堿基C變為T、第461位堿基G變為T、第484位堿基A變為G（圖5），說明KAP1.1基因表達載體構建成功。

2.4.2 氨基酸序列比對

與美利奴羊對比，山區型和田羊毛囊KAP1.1蛋白第13位Ile突變為Thr；第132位Tyr突變為His；第154位Cys突變為Phe、第162位Ile突變為Val。其氨基酸比對結果（圖6）。

圖5 美利奴羊和山區型和田羊毛囊KAP1.1基因序列比對結果（僅列出有差異的片段）

圖6 美利奴羊和山區型和田羊毛囊KAP1.1基因氨基酸序列比對結果（僅列出有差異的片段）

2.5 KAP1.1基因編碼蛋白的性質分析

2.5.1 基本理化性質分析

用在線ProtParam軟件對綿羊KAP1.1基因編碼蛋白的基本理化性質進行分析，結果顯示：與Gen-Bank中美利奴羊對比，山區型和田羊KAP1.1基因編碼蛋白的原子總數，平均疏水性和脂肪酸系數略低于美利奴羊。其中，山區型和田羊KAP1.1蛋白不穩定系數為71.73（＞40），說明該蛋白不穩定；脂肪族氨基酸系數為35.70，理論等電點為7.13，為典型的中性蛋白。

2.5.2 KAP1.1蛋白的二級結構預測

利用SOPMA在線軟件工具預測KAP1.1蛋白的二級結構，與GenBank中美利奴羊對，結果表明，和田羊與美利奴羊KAP1.1蛋白二級結構基本相同，其中無規則卷曲占大部分，α-螺旋、延伸鏈較少，無β-轉角（表1）。無規則卷曲受側鏈相互作用的影響很大，α-螺旋是手性結構，具有旋光能力，其穩定性與它的氨基酸組成和序列有極大關系。

表1 毛囊KAP1.1蛋白二級結構預測

2.5.3 KAP1.1蛋白的跨膜區分析

利用在線TMpred工具對KAP1.1基因編碼蛋白跨膜區和方向進行預測，結果顯示，山區型和田羊KAP1.1基因編碼蛋白由膜內向膜外可能存在3個跨膜區域，主要集中在第9、88、121位氨基酸處，由膜外向膜內可能存在3個跨膜區域，主要集中在第10、90、121位氨基酸處（圖7）。由此可見，KAP1.1基因編碼蛋白視為跨膜蛋白。

圖7 KAP1.1蛋白跨膜結構預測

2.5.4 KAP1.1蛋白的親疏水性分析

利用在線ProtScate工具對KAP1.1基因編碼蛋白親疏水性進行預測分析，結果顯示，KAP1.1基因編碼序列存在較多親水性和疏水性區域，說明KAP1.1基因編碼蛋白序列一部分蛋白表現為疏水性，一部分表現為親水性（圖8）。

圖8 KAP1.1蛋白的親疏水性分析

2.5.5KAP1.1基因的聚類分析

利用MEGA6.0軟件對不同物種KAP1.1基因序列進行聚類分析，并構建系統發育樹（圖9）。結果表明，山區型和田羊與美利奴羊最先聚集在一起，表明其親緣關系較近。

圖9 KAP1.1基因與其他物種間聚類分析

3 討論與結論

隨著我國紡織行業的不斷發展,羊毛在現代紡織工業中的作用日益顯著。細毛羊在草食畜動物牧業發展中占有重要地位［16］，是畜牧業重要的經濟來源。新疆是我國綿羊主要生產地之一，和田羊作為南疆地方品種，獨特的地理環境使和田羊具有被毛兩型毛多，長且均勻的特點，羊毛富有彈性，且光澤和潔白度良好，是紡織工業的優質原料。但也存在體型較小、產毛量、產肉率和繁殖率低等缺點。

試驗選取和田羊毛囊作為材料，通過基因克隆等分子生物學手段獲得和田羊毛囊KAP1.1基因序列大小為519 bp,可編碼172個氨基酸。利用BLAST軟件將GenBank中美利奴羊（HQ110109.1）與山區型和田羊的KAP1.1基因測序結果進行序列比對。結果表明:山區型和田羊與GenBank中美利奴羊序列堿基同源性高達98.65%，氨基酸同源性達97.09%。其中有7個堿基發生突變，由于遺傳密碼的簡并性，只是引起了4處氨基酸發生變異，其中，第162位Ile突變為Val，但對蛋白質的結構和功能影響不大，至于第13位的Ile變異為Thr、第132位Tyr變異為His、第154位Cys突變為Phe，對蛋白質的結構和功能造成的影響需要進一步的生物試驗支持。

利用SOPMA在線軟件對二級結構的預測可知，KAP1.1蛋白二級結構主要由無規則卷曲組成，此結構常與酶活性部位和蛋白質特異功能有關［17］，由此推測無規則卷曲是構成該蛋白的主要結構元件。α-螺旋含量極少，α-碳是手性結構，具有旋光能力，其穩定性與它的氨基酸組成和序列有極大關系，脯氨酸是一個結構比較特殊的氨基酸，脯氨酸的α-碳參與R基吡咯的形成，環內的N-Cα建不能旋轉，且脯氨酸的肽鍵不具有酰胺氫，不能形成氫鍵,因此，多肽鏈中只要存在脯氨酸，α-螺旋即被中斷［18］。在水溶液中脯氨酸缺乏能與螺旋i-4位置［19］的羰基形成氫鍵的酰胺質子并且影響其前一位置氨基酸殘基的扭轉角［19］，從而主要以伸展的構象存在。因此，在水溶性蛋白中脯氨酸被認為是螺旋結構的破壞者［20］。由于脯氨酸是影響α-螺旋的主要原因之一，由氨基酸序列比對結果可知，氨基酸序列中脯氨酸含量并不少，推測氨基酸序列中脯氨酸含量會影響α-螺旋形成，至于脯氨酸含量是否為影響α-螺旋結構的決定性因素，還需更進一步地試驗加以驗證。

跨膜區分析結果表明，KAP1.1基因編碼蛋白由膜內向膜外、膜外向膜內各有3個跨膜區域，由此可推測KAP1.1蛋白為跨膜蛋白。親疏水性分析結果顯示KAP1.1蛋白一部分蛋白表現為疏水性，一部分表現為親水性，結合跨膜區分析，KAP1.1蛋白為跨膜蛋白，跨膜蛋白包括外周蛋白和內在蛋白。因此，外周蛋白則表現為親水性，內在蛋白則表現為疏水性。

山區型和田羊與不同物種間KAP1.1基因系統發育樹［21］的結果反映了各物種間的親緣關系和進化關系，遺傳距離越小，親緣關系越接近，同源性越高［22］。山區型和田羊與美利奴羊最先聚集在一起，證明親緣關系最近，而野豬和犬與其他物種的差異特別大。

由于KAP含量可影響羊毛品質［23］且KAP含量變化和數量有可能是決定羊毛品質的一個重要因素，是編碼羊毛的結構蛋白基因之一，對羊毛的細度，強度，長度，光澤等品質有重要作用，KAP1.1基因成熟蛋白編碼序列高度保守，因此山區型和田羊KAP1.1基因可能是會影響羊毛的品質的因素之一。

試驗以新疆特色動物山區型和田羊為研究對象，成功構建了毛囊KAP1.1基因的表達載體，并對該基因的核苷酸和氨基酸序列進行了生物信息學分析。該研究將為探究南疆地方品種和田羊羊毛品質提供一定的實驗數據，毛囊KAP1.1基因表達載體的構建為進一步制備多克隆抗體提供了基礎材料，為深入探索綿羊功能性蛋白的表達提供理論依據。