MLH1、PRMT5在卵巢癌組織中的表達及意義

白璐，吳利英，呂艷紅，楊紅

(中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院婦產科，西安 710032)

卵巢癌是最為常見的惡性腫瘤之一，目前排在婦科惡性腫瘤的第三位，近年來發病率呈現升高趨勢，手術治療是臨床根治卵巢癌的方法之一，但是術后患者存在較高的復發轉移率，因此通過尋找早期可靠的血清學指標對卵巢癌病情發展變化進行判斷對于改善患者治療效果具有重要意義[1]。錯配修復蛋白MutL同系物1(MLH1)屬于人體DNA錯配修復基因家族重要的成員，其突變后會導致修復基因的功能缺失，誘導腫瘤發生。蛋白質精氨酸甲基化在生物體內廣泛存在且具有重要作用，精氨酸甲基轉移酶5(PRMT5)屬于催化此過程的關鍵酶，對細胞增殖、凋亡均具有重要作用，在多種惡性腫瘤呈現過度表達，但是對于兩種因子在卵巢癌中的研究相對少見[2]。本研究分析了MLH1和PRMT5在卵巢癌組織中的表達情況，以期為臨床提供指導和依據。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年1月至2019年8月中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院保存的卵巢癌組織標本132例作為卵巢癌組。納入標準：(1)均經病理學確診；(2)術前未行放化療等抗腫瘤治療；(3)臨床資料保存完整。排除標準：(1)合并有其他系統惡性腫瘤者；(2)合并有自身免疫系統疾病、血液系統疾病等其他嚴重基礎性疾病。選取同期因全子宮雙側附件切除術獲得的正常卵巢組織80例作為對照組。

二、試劑與方法

1.主要試劑及儀器：MLH1與PRMT5小鼠抗人單克隆抗體、DAB 染色液(北京中杉金橋)；Leica ASP300 S組織脫水機、Leica EG1150石蠟包埋機、Leica RM2255轉輪切片機(萊卡，德國)；蘇泊爾YL206 G1高壓鍋(蘇泊爾，法國)；DNP-9272電熱恒溫箱(上海精宏)。

2.實驗方法：采取免疫組化法對MLH1和PRMT5進行測定。標本在4%中性甲醛溶液中進行固定6 h，石蠟包埋后進行切片，厚度為3 μm；58℃烤箱烘干溶蠟3 h，石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度酒精進行水化，高壓鍋抗原熱修復3 min，PBS洗滌3次；一抗(稀釋比例1∶100)4℃孵育過夜后再次PBS洗滌3次，滴加二抗(稀釋比例1∶100)PBS洗滌3次；DAB顯色后自來水沖洗10 min，蘇木精復染60 s，1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗返藍、脫水，中性樹膠封片。隨機計數10個高倍視野，計算每個高倍視野中陽性細胞所占百分比，陽性細胞率大于20%為陽性表達，按照陽性表達例數與總例數計算陽性表達率。

三、統計學分析

統計分析采用SPSS 22.0軟件。計數資料比較使用χ2檢驗，相關性采用Spearman秩相關分析，生存曲線采用Kaplan-Meier法描繪，比較采用Log-rank檢驗。檢驗水準α=0.05。

結 果

一、卵巢癌和正常卵巢組織中MLH1、PRMT5的表達

MLH1、PRMT5主要表達于卵巢上皮細胞的胞質中(圖1)。卵巢癌組MLH1陽性表達率顯著低于對照組(P<0.05)，而PRMT5陽性表達率顯著高于對照組(P<0.05)(表1)。

A：卵巢癌組MLH1(×400)；B：卵巢癌組PRMT5(×400)；C：對照組MLH1(×200)；D：對照組PRMT5(×200)圖1 MLH1和PRMT5在卵巢組織中的定位(免疫組化染色)

表1 卵巢癌和正常卵巢組織MLH1、 PRMT5表達率[n(%)]

二、MLH1、PRMT5表達與卵巢癌臨床病理特征關系

FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期組織MLH1陽性表達率顯著低于Ⅰ～Ⅱ期組織(P<0.05)；FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化和有淋巴結轉移組織PRMT5陽性表達率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化和無淋巴結轉移組織(P<0.05)(表2)。

表2 MLH1、PRMT5表達與卵巢癌臨床病理特征關系

三、卵巢癌組織中MLH1和PRMT5相關性分析

MLH1陽性PRMT5陰性的病例有44例，MLH1陰性PRMT陽性的病例有61例，二雙陽性和雙陰性分別只有21例和6例，卵巢癌組織中MLH1與PRMT5表達呈負相關(rs=-0.605，P<0.05)(表3)。

表3 卵巢癌組織中MLH1和PRMT5相關性分析

四、MLH1與PRMT5表達與預后的關系

MLH1陽性/PRMT5陰性表達患者中位總體生存時間為19.80(12，25)個月，顯著高于MLH1陰性/PRMT5陰性患者[12.40(7，14)個月]、MLH1陽性/PRMT5陽性患者[10.40(6，14)個月]和MLH1陰性/PRMT5陽性患者[8.40(5，10)個月](P<0.05)(圖2)。

A：MLH1陽性/PRMT5陽性；B：MLH1陽性/PRMT5陰性； C：MLH1陰性/PRMT5陽性；D：MLH1陰性/PRMT5陰性圖2 不同MLH1與PRMT5表達組的生存曲線

討 論

卵巢癌是臨床女性最為常見的惡性腫瘤之一，幾年來發病率呈現升高趨勢，對女性生命健康和生活質量產生嚴重威脅，有報道指出卵巢癌的分期對患者預后產生嚴重影響，I期患者五年生存率可高達90%以上，而晚期卵巢癌患者五年生存率則僅為25%左右[3]。目前臨床卵巢癌患者多數就診時已處于中晚期，失去了手術根治的機會，因此早期診斷對于指導臨床治療和改善預后具有重要意義[4-5]。傳統的診斷方法是采取組織學檢查，但是卵巢的位置極為特殊，因此組織學檢查在卵巢癌的早期診斷中價值有限[6]。影像學檢查一直也是卵巢癌診斷的重要方法，常用的有超聲、CT以及核磁共振檢查，但是在檢查過程中可能受到醫師主觀因素影響，而且部分檢查具有輻射性，且費用高昂，在基層醫院使用受到限制[7-8]。血清學指標雖然是臨床診斷卵巢癌的重要依據，但是腫瘤標記物種類較多，而且影響因素較多，在部分子宮內膜異位或者盆腔炎癥病變中也會升高，因此臨床特異性不高[9]。近年來大量研究發現腫瘤最主要的生物學特征是侵襲與轉移，正常細胞在病理狀態下失去了極性轉換的活動能，腫瘤細胞在原發灶生長增殖，隨著黏附松解而脫落，同時釋放多種蛋白水解酶水解胞外基質、基膜，組織間隙被破壞導致腫瘤細胞向局部浸潤或經循環系統向遠處縱深發展[10-11]。

本研究MLH1和PRMT5在卵巢癌組織中的表達情況，目前認為人體基因失活一方面是遺傳學機制造成，基因缺失或者突變均會導致基因序列改變，屬于不可逆性改變，另一方面表觀遺傳學機制則是核苷酸序列未出現變化，基因通過化學修飾包括甲基化、非編碼等造成基因表達受到影響，具有可逆性[12-13]。錯配修復基因功能異常是導致腫瘤基因激活、抑癌基因失活和細胞周期改變的重要原因，最終會導致細胞發生惡變與腫瘤發生發展。MLH1是錯配修復基因家族重要的成員，該基因啟動子出現高甲基化后表達水平降低，造成DNA堿基錯配修復能力降低，DNA復制過程出現錯誤，誘發了腫瘤的發生[14]。既往研究認為MLH1屬于細胞保護性蛋白，MLH1蛋白缺失也會造成腫瘤細胞難以應對DNA損傷時對腫瘤細胞自身的影響，而且在結直腸癌的研究中發現其基因表達同腫瘤生物學行為關系密切，但是基因表達同腫瘤分級、分期和淋巴結轉移則不具有相關性[15-16]。人體正常細胞的增殖分化依靠細胞有序的周期性活動，PRMT5對細胞周期G1期調控具有重要作用[17]。有學者在乳腺癌患者中研究發現PRMT5會引發G1期阻滯、S期顯著縮短，從而抑制細胞增殖過程[18]。還有學者證實了PRMT5表達下降后細胞周期轉錄因子-1的表達會升高，抑制細胞生長，PRMT5直接甲基化還會導致細胞凋亡增加，但是臨床對于其在卵巢癌中的具體作用機制還未明確[19]。目前證實PRMT5在細胞正常生長、分化和發展方面具有關鍵作用，其過度表達同腫瘤細胞的過度增長有關，通過抑制其表達可以引發抑癌基因的轉錄抑制和細胞生長變慢，說明其具有成為卵巢癌基因治療靶基因的潛力[20]。

本研究顯示，卵巢癌組織MLH1陽性表達率明顯低于正常卵巢組織，而PRMT5陽性表達率明顯高于正常卵巢組織，說明在卵巢癌組織中MLH1陽性降低，PRMT5陽性表達升高。FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期組織MLH1陽性表達率顯著低于Ⅰ～Ⅱ期組織；FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化和有淋巴結轉移組織PRMT5陽性表達率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化和無淋巴結轉移組織，說明MLH1同卵巢癌分期有關，而PRMT5同卵巢癌的分期、分化程度以及是否存在淋巴結轉移有關。通過相關性分析發現，卵巢癌組織MLH1與PRMT5表達呈負相關。通過繪制生存曲線分析發現，MLH1陰性PRMT5陽性表達患者中位總體生存時間19.80個月長于MLH1陰性PRMT5陰性、MLH1陽性PRMT5陽性和MLH1陽性PRMT5陰性患者，這有助于對臨床醫師對患者預后進行早期預判。本研究優勢在于證實了卵巢癌組織中MLH1與PRMT5表達情況，為臨床合理尋找評估患者分期、分化程度以及淋巴結轉移尋找了新的分子生物學指標，但是本研究隨訪時間短，入組患者數量較少，而且受到多種因素影響可能導致結果存在偏倚，因此還需擴充樣本量、長期隨訪深入分析。

綜上所述，卵巢癌組織MLH1表達下調而PRMT5表達上調，與臨床病理特征有一定關系，值得進一步研究。