人工周期凍融胚胎移植后黃體支持中添加HCG的前瞻性隨機對照研究

黃愈，師娟子，李娜*

(1.西安醫學院，西安 710003；2.西安交通大學附屬西北婦女兒童醫院輔助生殖中心，西安 710003)

在凍融胚胎移植(FET)周期中，人工周期(HRT)準備內膜由于使用外源性雌孕激素促進子宮內膜的增殖與轉化，使用方便，可控性強，因此成為了常用的準備內膜方式。但由于HRT周期無黃體生成，胚胎移植后需要足量、全程的黃體支持[1]。

既往的研究認為HCG是利用其與LH相似的結構作用于LH受體，刺激黃體細胞產生雌孕激素進行黃體支持。隨著對HCG及其受體研究的深入，發現HCG在人類生殖的每一步均起著重要的作用[2]。目前對于黃體支持中使用HCG是否可以改善妊娠結局仍存在爭議?？紤]到HRT-FET周期無黃體形成，排除了HCG刺激黃體對妊娠的積極作用，可以反映HCG是否是通過改善母胎界面的交互作用從而改善臨床結局，進而為HCG在臨床中的合理應用提供依據，因此對我中心行HRT-FET周期的患者進行前瞻性隨機對照研究。

資料與方法

一、研究對象

本研究自2018年11月1日至2019年10月31日選取在西北婦女兒童醫院生殖中心行FET的患者進行前瞻性隨機對照研究。

1.納入/排除標準：年齡<40歲；FET第一周期；HRT準備內膜(包括GnRH-a+HRT方案)；排除子宮內膜異位癥、子宮畸形、轉化日子宮內膜厚度<8 mm以及進入其他研究的患者。

2.樣本量計算：研究設計為非劣性檢驗，把握度β 80%，取α雙側0.05，臨床妊娠率差異15%，得到樣本量每組150例。

3.隨機化方案：計算機隨機產生300個隨機號碼，分為A、B兩組，每組各150個。制作隨機分組表，計算機保存并隱藏。將上述獲得的300個隨機號碼，再次隨機分配給300個序列號。每入組一例患者，根據入組序列，輸入姓名、病歷號后獲得一個隨機號碼，由計算機揭盲分組組別，不能更改。

4.依從性分析：對納入患者進行依從者分析。依從者分析是指在分析中除去部分依從性不足的患者，僅對執行方案者進行分析。

本研究經我院倫理委員會審批通過并備案(倫理審批編號：2018027)。本研究臨床試驗注冊號：ChiCTR1800020342。每位患者在入組前均簽署書面知情同意書。

研究流程見圖1。

圖1 研究流程圖

二、研究方法

1.促排卵方案：根據患者的年齡、bFSH、竇卵泡情況選擇GnRH激動劑(GnRH-a)、拮抗劑(GnRH-ant)、其他方案進行促排卵。當平均直徑≥17～18 mm的卵泡占到平均直徑≥14 mm卵泡數量的60%以上時使用HCG扳機，常用劑量為HCG(珠海麗珠醫藥)4 000～10 000 U肌肉注射或艾澤(默克雪蘭諾，瑞士)250 μg皮下注射，注射后36 h取卵。

2.受精、胚胎培養及胚胎質量評價：根據患者丈夫精液情況，選擇IVF/ICSI授精。評分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級胚胎為可用胚胎，Ⅰ級和Ⅱ級為優質胚胎。繼續行囊胚培養者在D5或D6，應用Gardner評分法對囊胚進行評分[3]，3～4CC及以上為可用囊胚，3～4BB及以上為優質囊胚。

3.胚胎冷凍及復蘇按我中心常規進行。

4.內膜準備及胚胎移植：單純HRT方案于月經周期第3～5天行B超檢查后采用雌激素遞增方案，口服雌二醇(拜耳醫藥，德國)4～6 mg/d起始，雌激素遞增方案，B超監測子宮內膜>8 mm時，予黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)轉化內膜，根據胚齡選擇移植時機。GnRH-a+HRT方案在月經周期第2～5天給予GnRH-a(博福益普生，法國)3.75 mg肌肉注射1～3周期，末次注射后30 d左右開始準備內膜，方法同上。

卵裂胚的解凍在下午進行，培養過夜后次日移植，在移植前行輔助孵化；囊胚期胚胎的解凍在早上移植前進行，過程與胚胎解凍步驟相同，解凍后行輔助孵化。解凍后卵裂胚及囊胚的評分方法同前。根據患者條件移植1～2枚卵裂胚或囊胚。

5.黃體支持：所有入組患者均在轉化內膜日隨機分為 2組，并簽署知情同意書。(1)常規黃體支持(B組)：自胚胎移植日起黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)60 mg/d肌肉注射+地屈孕酮(雅培，荷蘭)20 mg/d口服。內膜準備階段的雌激素同前繼續使用。(2)添加HCG黃體支持(A組)：在內膜轉化日的第3天開始，給予HCG(珠海麗珠醫藥)2 000 U肌肉注射，隔日一次，連續4次。其余同常規黃體支持。

胚胎移植后根據患者意愿可將肌肉注射黃體酮換為陰道用黃體酮軟膠囊(法杏，法國)0.2 g陰道置入，3次/d或黃體酮緩釋凝膠(默克雪蘭諾，瑞士)1.125 g，1次/d，口服地屈孕酮改為10 mg口服，3次/d。黃體支持至孕70 d逐漸減量并停藥。

6.隨訪：卵裂胚移植后14 d測血HCG≥50 U/L、囊胚移植后9 d測血HCG≥25 U/L為HCG陽性。血HCG陽性者根據患者情況雌激素逐漸減量停藥，黃體酮繼續用藥至孕70 天逐漸減量停藥。移植后4周行陰道B超確定臨床妊娠。定期通過電話隨訪患者。臨床妊娠是指B超可見孕囊樣回聲(包括異位妊娠)；自然流產是指妊娠小于28周發生的流產。

7.統計指標及判定標準：D3可用胚胎率=可用胚胎數/2PN卵裂胚胎數×100%；D3優胚率=優胚數/2PN卵裂胚胎數×100%；囊胚形成率=可用囊胚數/行囊胚培養的胚胎總數×100%；種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=B超確定有孕囊的的周期數/移植周期數×100%；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、兩組基線情況比較

本研究共納入300例患者，其中A組150例，B組150例。兩組完成胚胎復蘇移植及隨訪者分別為124例及121例。兩組患者間年齡、不孕年限、不孕類型、不孕因素、AFC、BMI、bFSH相比均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

二、控制性促排卵(COH)方案及實驗室情況

兩組患者間COH方案、授精方式、HCG日E2水平、獲卵數、D3可用胚胎率、D3優胚率、囊胚形成率相比也均無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表1 兩組患者基線資料[(-±s)，n(%)]

表2 兩組患者COH方案及實驗室情況[(-±s)，n(%)]

三、FET周期臨床結局

在FET周期中，A組平均移植胚胎數多于B組，A組移植囊胚比例低于B組，差異均有統計學意義(P<0.05)；A組胚胎種植率及臨床妊娠率低于B組(分別為58.97% vs. 70.07%，66.94% vs. 74.38%)，但均無統計學差異(P>0.05)；兩組自然流產率比較無統計學差異(8.43% vs.8.89%，P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者FET周期妊娠結局[(-±s)，n(%)]

四、不同移植胚胎類型的FET周期妊娠結局

1.卵裂胚移植：兩組間內膜準備方案的選擇無統計學差異(P>0.05)，均以單純HRT周期方案為主；A組平均移植胚胎數略高于B組，胚胎種植率及臨床妊娠率均略低于B組，但均無統計學差異(P>0.05)；A組自然流產率略高于B組，亦無統計學差異(P>0.05)(表4)。

2.囊胚移植：兩組間內膜準備方案的選擇中無統計學差異(P>0.05)，均以單純HRT周期方案為主；A組平均移植胚胎數略高于B組，胚胎種植率、臨床妊娠率、自然流產率均略低于B組，但均無統計學差異(P>0.05)(表5)。

表4 兩組患者卵裂胚FET妊娠結局[(-±s)，n(%)]

表5 兩組患者囊胚FET妊娠結局[(-±s)，n(%)]

五、二元Logistic 回歸分析

通過前向法構建二元Logistic回歸模型，該模型的Hosmer和Lemeshow檢驗擬合度χ2統計值為1.758(P=0.972)，說明該模型能夠很好地擬合數據(P>0.05)。結果顯示：平均移植胚胎數[OR=0.343，95%CI(0.140，0.840)，P<0.05]及移植胚胎類型[OR=2.391，95%CI(1.051，5.439)，P<0.05]對是否臨床妊娠影響顯著；排除平均移植胚胎數及移植胚胎類型等混雜因素，黃體支持中添加HCG對臨床妊娠的影響并不顯著[OR=1.466，95%CI(0.826，2.604)，P>0.05](表6)。

表6 二元Logistic回歸分析

討 論

自從1983年人類第一次通過FET技術獲得妊娠以來，FET技術已經成為了輔助生殖中重要的一部分[4]。如何改善FET周期子宮內膜發育與胚胎發育的同步性，從而提高臨床結局成為了臨床中研究的熱點。隨著對HCG及其受體的研究深入，發現在胚胎發育至2PN階段即可在胚胎培養液中檢測到HCG，且其濃度與妊娠率呈正相關[5]。目前的研究發現HCG對胚胎種植及子宮內膜容受性均起著重要的作用[6-7]。但HCG是否可以改善FET周期子宮內膜發育與胚胎發育的同步性從而改善妊娠結局仍存在爭議。

在本研究中，HRT-FET周期黃體支持中添加HCG對妊娠結局的改善并未起到明顯的促進作用?？赡苄缘慕忉尰蛟S有：(1)HCG的黃體支持作用是刺激黃體細胞產生更多內源性激素改善黃體功能。但在HRT-FET周期，并無黃體細胞，無HCG作用的靶細胞。(2)胚胎來源的HCG在局部植入位點表達的HCG量或許就足以支持母胎界面的分子對話。

Fazleabas等[8]在HRT周期中給狒狒宮腔內灌注HCG后可以誘導間質細胞和腺上皮蛋白的表達從而改善子宮內膜環境[8]；Licht等[9]發現HCG宮腔灌注后不利于胚胎植入的因子水平被顯著抑制，而促進胚胎植入的因子水平顯著增加。在胚胎植入時，HCG等激素的調控胚胎及子宮內膜進行信號釋放及應答，通過信號途徑，不斷調整自身，調節母胎界面的交互作用[10]，促進胚胎植入。但張樂等[11]的Meta分析顯示，胚胎移植前宮腔灌注HCG僅在移植卵裂胚，且HCG濃度>500 U時可改善妊娠結局。以上研究提示了HCG濃度及胚胎發育程度對妊娠結局的重要作用。以上研究提示了HCG宮腔灌注對妊娠結局起著積極的作用。目前臨床中使用的HCG藥物制劑(包括尿源性或基因重組來源者)中在胚胎植入過程中起著重要作用的高糖基化HCG(H-HCG)含量少，大部分為常規HCG；并且，HCG兼具內分泌和旁分泌作用，HCG肌肉注射后子宮內膜局部的H-HCG濃度可能更低，這也可能是宮腔灌注HCG可通過旁分泌起到促進胚胎著床的作用，而肌肉注射用藥效果不佳的可能原因之一。

2017年Shiotani等[12]的研究共納入173例HRT-FET周期的患者，在HRT周期D17和D20移植胚胎，研究組在第17、20、23天給予3 000 U HCG，結果表明添加HCG并未明顯改善臨床妊娠率、種植率；2012年Eftekhar等[13]對130個HRT-FET周期進行了隨機對照研究，HCG組(在內膜轉化日及胚胎移植日各給予HCG 5 000 U)的種植率、臨床妊娠率、持續妊娠率和流產率與對照組相比均無顯著差異。然而，該研究團隊在隨后的研究中增加樣本量(200例)并改變用藥方案，HCG組患者從移植日開始每72 h肌肉注射HCG 5 000 U，共3次，結果發現HCG組較對照組HCG陽性率、臨床妊娠率明顯增加，且流產率有降低的趨勢[14]。賈學玲等[15]回顧性分析了156個HRT-FET周期，發現在HRT周期添加小劑量HCG可以改善FET患者的子宮內膜厚度、血流及妊娠結局。劉燕[16]對97例患者行前瞻性隨機對照研究，均使用GnRH-a +HRT周期準備內膜，研究組在內膜達標時單次注射rHCG 250 μg，兩天后予黃體酮轉化內膜；與對照組(直接轉化內膜)相比，胚胎種植率(42.55% vs. 21.28%，P<0.05)及臨床妊娠率(59.57% vs. 38.30%，P<0.05)均顯著增高，作者認為在HRT周期肌肉注射HCG可以改善臨床妊娠結局。綜上所述，關于在HRT-FET周期黃體支持中添加HCG的有效性，目前的研究中患者異質性很大，結果及結論也不盡相同。

我們的研究提示，在HRT-FET周期黃體支持中添加HCG并不能改善妊娠結局，且胚胎種植率有下降的趨勢。因此，不建議在HRT-FET周期黃體支持中添加HCG。異常的HCG刺激還可能有害于胚胎種植。Evans等[17]比較了輔助生殖技術受孕婦女與自然受孕婦女的子宮內膜細胞培養結果，發現延長使用低劑量HCG可以下調HCG受體表達，觸發HCG受體內化，使受體下游傳導信號脫敏，尤其是立即使用模擬囊胚來源的高劑量的HCG后尤其嚴重，結果導致子宮內膜細胞粘附能力和緊密連接調節受損。

本研究的優勢在于前瞻性隨機對照研究，有嚴格納入/排除標準，患者可比性較好。但本研究同樣有其局限性，包括：最終納入樣本量小，有待擴大樣本量進行研究；排除了于子宮內膜<8 mm、高齡、多周期者等條件較差的患者，可能使得研究結論的普適性有限；兩組患者間移植胚胎數目及移植胚胎類型不同，有待擴大樣本量細化分組分析。

綜上所述，本研究發現HRT-FET周期黃體支持中添加HCG并未明顯改善患者的臨床妊娠結局，不建議在HRT-FET周期黃體支持中添加HCG。需要有多中心的大樣本前瞻性隨機對照安慰劑盲法研究，以進一步研究添加HCG在HRT-FET周期黃體支持中的有效性(包括適用人群、添加時機和方案等)以及相關機制，從而為HCG在臨床的合理應用提供依據。