NH2-MCM-41的改性及其pH響應性釋藥的研究

徐彥芹，秦釗，王燁，曹淵，陳昌國，王丹

（1重慶大學化學化工學院，重慶401331；2重慶大學煤礦災害動力學與控制國家重點實驗室，重慶401331）

引 言

介孔材料（mobil composition of matters, MCM?41）具有可調可控的孔道、高比表面積等特點，使其在吸附[1]、催化[2]、傳感技術[3]及藥物輸送[4]等領域應用廣泛。其中，利用介孔材料作為實現藥物緩控釋功能的載體，是近年來藥物遞送系統載體材料研究熱點之一[5]。MCM?41 作為載體應用在緩釋給藥系統時，具有可調節的孔徑和粒徑、比表面積大、易于功能化、高度的生物相容性[6?9]等優點，可控制藥物分子的吸附和釋放達到更好的緩釋給藥效果[10]。自2001年Vallet?Regi等[11]首次將MCM?41作為釋藥載體之后，越來越多的智能響應（如：pH 響應[12]、溫度響應[13]、光響應[14]、磁性[15]）的藥物載體被研發出來，具有良好的生物相容性、較高的載藥量、零提前釋放、可控的釋藥行為等多個優點[16]。

pH 響應性MCM?41 是目前研究熱門的智能響應藥物載體，能彌補化療缺乏專一性的缺陷，給癌癥的靶向治療提供了新的轉機[17?20]。如Gui 等[21]將溶菌酶分子修飾在MCM?41 納米球上，研究了RhB的pH 響應性釋放行為；Zhao 等[22]將β?環糊精修飾在MCM?41上，研究了pH和光雙控的藥物響應性釋放行為。pH 響應性MCM?41 通常是在MCM?41 介孔孔道或者材料表面上，引入巰基、氨基、羧基等官能團[23?25]，使其具有pH 響應性。其中，據文獻報道，氨基化MCM?41 主要通過嫁接法合成并研究其吸附性能，如Yue 等[26]將介孔材料浸漬在TEPA 中，制備氨基功能化材料，用于對CO2的吸附；Goscianska等[27?29]通過嫁接法將氨基官能團負載在材料表面，通過回流制備氨基功能化介孔材料，對CO 和CO2有很好的吸附效果。而在孔道內接枝有機官能團的藥物載體及其釋藥性能的研究鮮見報道。MCM?41的有機修飾趨于復雜，藥物釋放效果有待提高。

本文將通過共縮聚法合成介孔MCM?41 納米微球，氨基化后再通過接枝法在NH2?MCM?41 孔道內引入有機修飾后的苯胺基團，得到改性的R?Ph?NH?MCM?41（其 中—R：—OH、—CH3、—COOH、

—CHO）藥物載體。羅丹明（RhB）是一種熒光染料，常用作載藥性能研究的模型藥物[30]，因此本文將采用RhB作為模型載藥，其釋藥示意圖如圖1所示。通過配制三種不同pH 的模擬體液，模擬人體胃部（pH 為0.9～1.5）、小腸（pH 為4.8～8.2）、口腔（pH 為6.6～7.1）[31]三種環境，研究不同—R 基團藥物載體中氨基在不同pH 環境下的質子化作用[12,32?33]，來達到控制藥物釋放的目的。

1 實驗部分

1.1 試劑

N,N?二甲基甲酰胺(DMF)、鹽酸、氨水、甲醇、碳酸鉀，成都科龍化工試劑廠；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），國藥集團化學試劑有限公司；正硅酸乙酯（TEOS），天津光復精細化工研究所；3?氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），阿拉丁試劑（上海）有限公司；羅丹明B（RhB），湖南湘中地質研究所；以上均為分析純。對氯苯甲酸（99%）、對氯苯酚（98%）、對氯甲苯（97%）、對氯甲醛（98%），均來自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 MCM-41的制備

將1.0 g CTAB 溶于100 ml 去離子水和70 ml 氨水的混合溶液中，加熱攪拌，待溫度到達60℃后，緩慢滴加5 ml TEOS，繼續攪拌7 h。室溫下放置7 h晶化，過濾，用去離子水及無水乙醇洗滌。60℃下真空干燥24 h 后，取1.0 g 產物加入到100 ml 質量比為2.5%的鹽酸乙醇溶液回流24 h，以去除模板劑，洗滌至中性，真空干燥，制得純介孔二氧化硅，記為：MCM?41[34]。

1.3 NH2-MCM-41的制備

將1.0 g CTAB 溶于100 ml 去離子水和70 ml 氨水的混合溶液中，加熱攪拌，待溫度到達60℃后，緩慢滴加5 ml TEOS，1 h 后，緩慢滴加1.0 ml APTES，繼續攪拌6 h。室溫下放置7 h晶化，過濾，用去離子水及無水乙醇洗滌，60℃下真空干燥24 h。取1.0 g產物加入到100 ml 質量比為2.5%的鹽酸乙醇溶液回流24 h，以去除模板劑，洗滌至中性，真空干燥，制得氨基改性介孔二氧化硅，記為：NH2?MCM?41[35]。

1.4 pH響應型MCM-41的制備

1.4.1 Me?Ph?NH?MCM?41 的制備合成 取2 g NH2?MCM?41 溶于50 ml 甲醇溶液中，加入1 ml 對氯甲苯，在60℃下水浴反應8 h，過濾，用甲醇溶液洗滌，60℃下真空干燥12 h，得到樣品，記為：Me?Ph?NH?MCM?41。

1.4.2 OHC?Ph?NH?MCM?41 的制備合成 取1.0 g 對氯苯甲醛溶于50 ml 甲醇溶液中，攪拌1 h 后，加入2 g NH2?MCM?41，在60℃下水浴反應8 h，過濾，用甲醇溶液洗滌后加入到稀鹽酸溶液中攪拌0.5 h，過濾，洗滌，60℃下真空干燥12 h，得到樣品，記為：OHC?Ph?NH?MCM?41。

1.4.3 HO?Ph?NH?MCM?41 的制備合成 取3 g 碳酸鉀和1.5 g 對氯苯酚加入到50 ml 無水DMF 中，攪拌1 h 后，加入2 g NH2?MCM?41，在60℃下水浴反應8 h，過濾，用乙醇溶液洗滌，后用稀鹽酸溶液和水溶液反復洗滌，真空60℃干燥12 h，得到樣品，記為：HO?Ph?NH?MCM?41。

1.4.4 HOOC?Ph?NH?MCM?41的制備合成 取3 g碳酸鉀和1.5 g 對氯苯甲酸加入到50 ml 無水DMF中，攪拌1 h 后，加入2 g NH2?MCM?41，在50℃下水浴反應8 h，過濾，用乙醇溶液洗滌，后用稀鹽酸溶液和水溶液反復洗滌，60℃下真空干燥12 h，得到樣品，記為：HOOC?Ph?NH?MCM?41。

1.5 載藥介孔二氧化硅的制備

取50 mg上述的產物分別放入到含有1 mg羅丹明B（RhB）的4 ml 甲苯與乙醇的混合溶液（甲苯∶乙醇= 4∶1）中，超聲分散4 h，過濾洗滌后，將產物在60℃下真空干燥至恒重，得到負載RhB 的載藥介孔二氧化硅，分別記為：RhB@Me?Ph?NH?MCM?41、RhB@OHC?Ph?NH?MCM?41、 RhB@HO?Ph?NH?MCM?41、RhB@HOOC?Ph?NH?MCM?41。

1.6 材料的表征

采用X 射線衍射儀（XRD，日本島津，XRD?6000）、紅外光譜儀（FT?IR，Nicolet 公司，MagnaIR55 0II）、比表面積測定儀（BET，Micromeritics 公司，ASAP2020M）、馬爾文激光粒度分析儀（Malvern 公司，Zetasizer Nano）、掃描電子顯微鏡（SEM，FEI 公司，JSM?6490LV）對材料進行表征。XRD 掃描范圍為2°～5°，掃描速度為0.5(°)/min，表征MCM?41 的晶體結構及晶型。BET 表征將樣品置于180℃下脫氣12 h，并在77 K下進行氮氣吸附脫附，測算其比表面積、孔徑分布和孔容。FT?IR 采用KBr 壓片法，掃描波長范圍為：450～4000 cm?1。馬爾文激光粒度儀測量材料的Zeta電位值以及SEM觀察材料表面形貌。

1.7 吸附性能測試

使用紫外可見熒光光譜儀（日本島津，RF5301?PC）通過熒光光度分析法來測定藥物載體對RhB 的吸附量。首先建立RhB 紫外吸收標準曲線，以無水乙醇為溶劑配制質量濃度為250 μg/ml的RhB?無水乙醇溶液。掃描范圍為：551～572 nm，吸收標準曲線為：ρ=0.00187Int+0.00441（其中ρ為RhB溶液質量濃度（mg/L），Int 為溶液的熒光強度）。通過測定溶液中RhB 的濃度，根據式（1）和式（2）分別計算介孔二氧化硅的吸附量AC（adsorption capacity）和載藥量LC（loading capacity）。

式中，m0為RhB 的質量，mg；ρ1為載體吸附后RhB 溶液的質量濃度，mg/L；V1為吸附后RhB 溶液的體積，L；m為MCM?41的質量，g。

1.8 釋藥性能測試

通過熒光光度分析法測定介孔二氧化硅對RhB的累積釋藥率Ri。稱取一定質量M（40 mg）的RhB@SiO2樣品，加入到50 ml 不同pH 的緩沖溶液中，37℃下恒溫振蕩，間隔一定的時間（t）取3 ml，同時加入緩沖溶液3 ml。繪制吸收標準曲線。建立RhB 在鹽酸（pH = 1.2）、磷酸二氫鉀?檸檬酸（pH =4.0）和硼砂?硼酸（pH=7.4）三種緩沖溶液體系的工作 曲 線 分 別 為 ：ρ=0.00555Int?0.02869、ρ=0.00283Int?0.00432、ρ=0.00198Int?03774。繪制t?Ri曲線，得到介孔二氧化硅的釋藥動力學曲線，計算公式如式(3)：

式中，ρi為第i次移出液中測定的質量濃度，mg/L；M為樣品質量。

為了進一步探究樣品在不同pH 下的釋藥行為 ，通 過 Zero?order、First?order、Hihuchi 和Korsmeyer?Peppas 等動力學模型方程對不同pH 下的累積釋藥量和時間進行擬合[36]，各動力學模型方程如下。為t 時間內的累積釋藥量；Q0為初始濃度；K0為所對應的動力學釋藥模型的動力學常數；n為釋放指數。

在上述模型中，Korsmeyer?Peppa 釋藥模型是目前應用最多的模型，結合了擴散作用和溶蝕作用，認為這兩種的協同作用是控制藥物釋放的關鍵。釋放指數n 值是作為Korsmeyer?Peppa 釋藥模型中控制藥物釋放作用的判斷依據，當n＜0.45 時，藥物

2 實驗結果與討論

2.1 X射線衍射譜圖（XRD）分析

圖2 分別是NH2?MCM?41、Me?Ph?NH?MCM?41、OHC?Ph?NH?MCM?41、HO?Ph?NH?MCM?41、HOOC?Ph?NH?MCM?41 的X 射 線 衍 射 譜 圖，從NH2?MCM?41 的 譜 圖 中，可 以 看 到 典 型 的 晶 面（100）的特征衍射峰，還有晶面（200）的特征衍射峰，可以判斷出NH2?MCM?41 屬于長程有序的六方相孔結構。對于其他的四條譜線，可以看到明顯的屬于MCM?41 的晶面（100）特征峰，為六方相孔結構。

圖2 NH2?MCM?41和四種藥物載體的XRD譜圖Fig.2 XRD patterns of NH2?MCM?41 and four drug carriers

2.2 氮氣吸附-脫附分析

圖3 分別是NH2?MCM?41、Me?Ph?NH?MCM?41、OHC?Ph?NH?MCM?41、HO?Ph?NH?MCM?41、HOOC?Ph?NH?MCM?41 的氮氣吸附?脫附等溫線及孔徑分布圖。在低壓區樣品的吸附脫附等溫線呈現快速上升狀態，在中壓區上升趨勢有所緩解，在高壓區又出現快速上升趨勢。五種吸附?脫附等溫線都屬于Langmuir Ⅳ型吸附等溫線。圖中出現了回滯環，吸附?脫附等溫線屬于H4 型，根據回滯環的類型分析，得知孔屬于狹窄孔道結構[37]。孔結構參數見表1。

2.3 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析

圖3 NH2?MCM?41和四種藥物載體的氮氣吸附?脫附等溫線和孔徑分布圖Fig.3 N2 adsorption/desorption isotherm and pore size distribution of NH2?MCM?41 and four drug carriers

表1 NH2-MCM-41和四種藥物載體的孔結構參數Table 1 The pore structural parameter of NH2-MCM-41 and four drug carriers

圖4為NH2?MCM?41及四種藥物載體的紅外光譜圖。從圖中可知5 個譜線在波長為1080 cm?1為Si—O—Si 硅氧鍵的反對稱伸縮振動峰，在800 cm?1為Si—O—Si 硅氧鍵的對稱伸縮振動峰，在950 cm?1為Si—O 硅羥基的彎曲振動峰，以上均為二氧化硅的特征峰。而在2917 cm?1和2850 cm?1為亞甲基的伸縮振動峰，1384 cm?1為C—H 彎曲振動峰，1508 cm?1處為—NH—的振動峰，在800 cm?1處同時也為苯環對位取代的特征峰，基本可以確定結構—NH?Ph?R 的存在，在1645 cm?1處為樣品中水的彎曲振動峰及C O 伸縮振動峰，在譜線d 和e 中1205 cm?1處有一峰為C—O 伸縮振動峰，從以上分析說明目標載體已經成功接枝上了響應官能團。

圖4 NH2?MCM?41和四種藥物載體的FT?IR譜圖Fig.4 FT?IR spectra of NH2?MCM?41 and four drug carriers

2.4 SEM分析

圖5 為四種藥物載體的SEM 圖。從SEM 圖中可以看出四種藥物載體形貌為六方棱柱，其中主要以短棱柱為主。四種不同的藥物載體是以NH2?MCM?41 為反應底物制備的，本身形貌并沒有太大的差異，均為六方短棱柱形貌。

2.5 電位分析

表2中列出了NH2?MCM?41和四種藥物載體的Zeta 電位值。由表可以看出NH2?MCM?41 以及四種藥物載體的Zeta 電位值分別為+29.2、+8.1、+4.2、?15.7 和?31.4 mV。由于NH2?MCM?41 結構中存在著氨基，氨基在水中呈現出正電荷，所以NH2?MCM?41 的Zeta 電位值為+29.2 mV。Me?Ph?NH?MCM?41、OHC?Ph?NH?MCM?41 中 的 —CH3、—CHO 兩種基團在水中都呈現中性，但其Zeta 電位值分別為+8.1、+4.2 mV，這是因為反應前體是NH2?MCM?41，反應不能完全進行，導致了氨基的殘留，所以在水中呈現正電荷。而對于HO?Ph?NH?MCM?41、HOOC?Ph?NH?MCM?41，其Zeta 電位值分別為?15.7、?31.4 mV，這是由于—OH、—COOH兩種基團在水中都呈現電負性，且羧基的酸性比羥基的酸性強。綜上所述，可以得知基于不同苯胺基團響應體系已經反應接枝完成。

圖5 四種藥物載體電鏡圖Fig.5 SEM images of four drug carriers

表2 NH2-MCM-41和四種藥物載體的Zeta電位值Table 2 Zeta potential of NH2-MCM-41 and four drug carriers

表3 NH2-MCM-41和四種載藥載體的吸附量及載藥量Table 3 The adsorption capacity and drug loading capacity of four drug carriers and NH2-MCM-41

2.6 吸附及載藥分析

表3為NH2?MCM?41和四種不同載藥載體的吸附量和載藥量[計算方式詳見1.7 節中式（1）、式（2）]，RhB@NH2?MCM?41、RhB@Me?Ph?NH?MCM?41、RhB@OHC?Ph?NH?MCM?41、RhB@HO?Ph?NH?MCM?41、RhB@HOOC?Ph?NH?MCM?41 的 載藥量分別為16.60、12.94、13.27、12.94、12.65 mg/g。相比于NH2?MCM?41，四種載藥載體的載藥量減少，這是因為在合成過程中，內部孔道壁上結構發生改變，孔道變小，孔容積變小，這使得載藥量有所降低。

2.7 釋藥分析

2.7.1 四種載藥載體的釋藥分析 四種藥物載體的累積釋藥百分比如表4所示，可以看出在pH=7.4的中性環境下累積釋藥量極低，而在pH = 4.0 以及pH=1.2 的酸性環境中累積釋藥量較高。說明載藥載體在中性非響應環境下，幾乎沒有釋藥行為；而在酸性響應環境下，釋藥性能較好，且酸性越強，累計釋藥量越高。

2.7.2 四種載藥載體的釋藥動力學分析 從表5擬合結果中的相關系數R2來看，四種藥物載體的藥物釋放均符合Korsmeyer?Peppa 動力學釋藥模型，且釋放指數n 值在不同pH 環境下都小于0.45，可以判斷出四種藥物載體藥物釋放主要是Fick 擴散作用控制。

表4 四種載藥載體累積釋藥百分比Table 4 Cumulative drug release percent of four drug carriers

表5 四種藥物載體藥物釋放曲線擬合結果Table 5 Results of drug release curve fitting of four drug carriers

2.7.3 釋藥性能對比分析 圖6 是四種載藥載體RhB@Me?Ph?NH?MCM?41、 RhB@OHC?Ph?NH?MCM?41、RhB@HO?Ph?NH?MCM?41、RhB@HOOC?Ph?NH?MCM?41 在pH = 1.2、4.0 和7.4 時的釋藥曲線。由于四種不同載藥載體的藥物釋放主要作用是無規則的Fick 擴散機制，那么對于四種不同的載體，影響其釋藥的主要原因是—R 基團的作用。在pH=7.4 時，四種不同載體的釋藥量相差不大，均接近零釋放；而pH=4.0下的各載體釋藥量較pH=1.2下低，且不同—R 基團的藥物載體釋藥量在同一pH環境下相差較大。可以得出：R?Ph?NH?MCM?41中的—R 基團在中性的非響應環境中，不同—R 基團對載體釋藥量影響不大；而—R 基團在酸性的響應環境中，由于存在氨基質子化作用，不同—R基團對載體釋藥量影響較大，如在pH=1.2 時，RhB@Me?Ph?NH?MCM?41 釋 藥 百 分 比 為 34.63%，而RhB@HOOC?Ph?NH?MCM?41 釋 藥 百 分 比 為57.87%，后者為前者的1.67倍。因此，—R基團只在酸性環境中發生作用，且酸性越強，影響越大，達到了緩控釋的效果。

3 結 論

以3?氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）修飾介孔二氧化硅，通過共縮聚合法合成NH2?MCM?41，再與對氯甲苯等有機物反應得到R?Ph?NH?MCM?41藥物載體。通過表征、載藥和釋藥性能測試，表明材料具有良好的藥物控釋pH 敏感性。將Me?Ph?NH?MCM?41、OHC?Ph?NH?MCM?41、HO?Ph?NH?MCM?41、HOOC?Ph?NH?MCM?41 四種載體裝載RhB，載藥性能良好。通過體外釋藥模擬發現，四種載體都具有pH 響應性，其中在pH=1.2的響應條件下，由于存在氨基質子化作用，四種載體累積釋藥量較高，分別為34.63%、52.03%、43.94%、57.87%；而在pH = 7.4 的非響應條件下累積釋藥量極低，分別為3.21%、3.12%、3.06%、3.09%，幾乎達到零釋放。因此可通過調節pH 來達到藥物控釋的目的，其中HOOC?Ph?NH?MCM?41 藥物載體在用于藥物智能控釋材料方面具有一定的應用潛力。