熒光素酶表達的腦膠質瘤小鼠模型的建立

李雨瑩，羅凱倫，鄒宗幸，劉濱磊，汪 洋

(湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068)

腦膠質瘤是對神經功能影響最大、最直接的神經外科疾病。腦膠質瘤具有較高的侵襲性，即便采取手術及放化療等治療措施，預后依然較差，大部分腦膠質瘤患者在接受綜合治療后仍容易復發[1]。建立一個穩定的膠質瘤動物模型可以更好地幫助研究針對腦膠質瘤的治療方法。常見的腦膠質瘤模型通常需要處死荷瘤小鼠，這樣一來就不能實時且準確地反映腫瘤在裸鼠體內的生長狀況[2-3]。活體動物體內光學成像技術主要包含生物發光或激發熒光兩種技術，前者如熒光素酶，后者如綠色熒光蛋白等[4]。熒光成像既可以標記動物、細胞和微生物，也可以是抗體或納米材料等較廣泛的對象。生物發光不需要激發光源背景，且具有較高的特異性和靈敏性，是研究腫瘤生長及發展穩定且有效的技術手段[5-7]。人腦膠質瘤的研究中，U87MG是最常用的細胞系之一[8]，將帶有熒光素酶(luciferase)的質粒PBDP-Firely Luciferase利用Lipofactamine 3000轉染進入U87MG細胞，得到穩定表達熒光素酶的細胞系。將表達熒光素酶的U87MG細胞原位注射進入裸鼠的顱內，建立表達熒光素酶的裸鼠模型，并通過動物活體成像技術觀察腦膠質瘤在裸鼠體內的生長和發展[9]，并對該細胞株的成瘤性進行評估。

1 實驗材料

PBDP-Firely Luciferase質粒由本實驗室前期的實驗研究中構建完成；pSPBT輔助質粒由System Biosciences公司獲得；U87MG細胞從中國科學院細胞庫購得；U87MG及改造后的細胞株U87MG-FLUC均用DME/F-12 (HyClone, USA)培養；胎牛血清購自四季青品牌(浙江天杭生物科技股份有限公司)；轉染試劑盒Lipofactamine 3000購自ThermoFisher Scientific公司；轉染介質培養基用MEM(HyClone, USA)，熒光素酶底物購自碧云天生物技術公司；無內毒素大提試劑盒購自天根生物科技有限公司；嘌呤霉素購自Promega。

2 實驗方法

2.1 篩選U87MG的最佳嘌呤霉素濃度

將培養于10%胎牛血清的DMEM培養基中的U87MG細胞消化得細胞懸液，按照5×104個/孔的細胞量接種于24孔板中，放置于5% CO2、37℃培養箱中培養24 h。嘌呤霉素按照0、5、10、15、20、25、30 μg/mL設置濃度梯度，連續觀察U87MG細胞的生長及存活狀態。細胞在5～7 d內全部死亡的孔所對應的嘌呤霉素濃度，將最低致死濃度選為篩選單克隆U87MG細胞的最佳濃度。

2.2 轉染U87MG細胞

將處于對數生長期的U87MG細胞，以5×104個/孔的細胞量接種于24孔板中培養24 h，當細胞匯合度達到90%左右時轉染質粒。按照Lipofactamine 3000說明書進行轉染實驗，將PBDP-Firely Luciferase質粒和pSPBT質粒按照5∶1的質量比加入到無血清的MEM培養基中記為A管，向A管中加入P3000試劑。將Lipofactamine 3000與MEM混合記為B管，A管與B管輕微混勻室溫靜置10 min后，加入到培養的U87MG細胞中，并繼續培養48～72 h，觀察GFP熒光蛋白表達的情況，并用嘌呤霉素進行篩選。

2.3 篩選單克隆細胞

用嘌呤霉素篩選后的細胞，GFP表達達到70%以上時消化細胞獲得細胞懸液，再將細胞懸液梯度稀釋至500個/mL接種于96孔板中，使每孔1～2 個細胞。培養24 h以上觀察細胞，記錄僅有單個細胞的孔。

2.4 流式細胞術檢測單克隆細胞株的純度

熒光顯微鏡下選取表達GFP熒光蛋白的單克隆細胞，擴培至6孔板中，待細胞匯合度達到90%時，消化細胞并用PBS清洗重懸細胞，用BD C6 流式細胞儀檢測U87MG-FLUC中GFP的表達率，并用FlowJo VX分析流式結果。

2.5 各單克隆細胞株熒光值檢測

消化篩選出來的單克隆陽性細胞株，用PBS重懸細胞并按照梯度稀釋為4×105、2×105、1×105、5×104、2.5×104、1.25×104、6250、3125個細胞接種到96孔板中，設置僅有PBS的孔作為空白對照，加入等體積工作濃度的D-Luciferin，使用多功能酶標儀分析生物發光強度。

2.6 細胞生長曲線繪制

取篩選的U87MG-FLUC細胞和為改造的U87MG細胞，按照1×104/孔接種至96孔板中，接種后的24, 48, 72及96 h 消化細胞并計數。

2.7 BALB/c裸鼠顱內植瘤模型的建立

BALB/c裸鼠，6周齡雌性2只。收集U87MG-FLUC單克隆細胞，用PBS清洗重懸為2×107/mL。2只裸鼠顱內接種50 μL的U87MG-FLUC細胞懸液。注射細胞懸液后的7 d，用動物活體成像系統(PerkinElmer, MA, USA)拍攝生物發光。

3 實驗結果

3.1 質粒轉染U87MG細胞并用嘌呤霉素篩選

選用PB轉座子載體質粒PBDP-Firely Luciferase和輔助質粒pSPBT。其中PBDP-Firely Luciferase質粒上帶有綠色熒光蛋白GFP標簽，作為質粒轉染細胞的檢測標記物。

經過嘌呤霉素篩選之后，確定了添加嘌呤霉素的最佳添加濃度為15 μg/mL。將PiggyBac(PB)轉座子載體質粒系統PBDP-Firely Luciferase質粒和輔助質粒pSPBT轉染進入U87MG細胞中，24 h后可見明顯的綠色熒光，表明轉染成功。向轉染后的細胞中加入15 μg/mL的嘌呤霉素，每24 h觀察U87MG細胞，5 d后質粒未轉染成功的細胞死亡，存活的均為U87MG-FLUC細胞。

3.2 挑取U87MG-FLUC單克隆細胞株

將轉染成功的U87MG-FLUC細胞，稀釋加入96孔板中培養。24 h后挑出僅有單個細胞的孔繼續培養擴增，當細胞匯合度達到80%以上后選取細胞形態未發生變化的U87MG-FLUC單克隆細胞株兩株，觀察其表達綠色熒光蛋白的情況(圖1)。

圖1 U87MG-FLUC單克隆細胞

3.3 流式細胞儀檢測U87MG-FLUC單克隆細胞

通過流式細胞儀檢測U87MG-FLUC細胞株的綠色熒光蛋白GFP的表達，對照組為未轉染質粒的U87MG培養細胞(圖2)，E7細胞株的GFP表達率達到98.7%，D3細胞株的GFP表達率達到100%，選取D3株做進一步的研究。

圖2 流式細胞儀檢測單克隆細胞

3.4 U87MG-FLUC細胞系的生長特性及熒光素酶的表達

對不同培養時間的U87MG-FLUC單克隆細胞進行細胞計數。觀察到U87MG-FLUC單克隆細胞與未改造的U87MG細胞有相似生長曲線(圖3)。選取第6,9, 12代次的U87MG-FLUC細胞加入熒光素酶底物檢測，隨著細胞培養代次的增加，熒光素酶活性保持穩定(圖4)。進一步，取第12代進行梯度稀釋，熒光素酶活性與細胞個數成線性相關(R2=0.9706)(圖5)。

圖3 U87MG和U87MG-FLUC生長曲線

圖4 不同代次細胞的熒光強度

圖5 細胞個數與熒光強度相關

3.5 裸鼠顱內植瘤模型的建立

收集U87MG-FLUC細胞，對裸鼠顱內接種。7 d后使用小鼠活體成像系統檢測到裸鼠顱內有明顯的熒光信號。

圖6 動物活體成像拍攝

4 結束語

通過轉染質粒，構建了穩定表達熒光素酶的人腦膠質瘤細胞系。細胞內表達熒光素酶可以催化體外導入的熒光素酶底物D-熒光素，所產生的550～580 nm的熒光，具有較強的組織穿透能力，可有效穿透深層組織[5]。對于無法使用游標卡尺直接對病灶進行測量的腦膠質瘤的模型而言，產生熒光素酶的腫瘤細胞系更能清晰反映腫瘤的發生和發展過程，為觀察腫瘤病灶的形成提供直觀且可以量化的數據[7,10]。

本實驗將PBDP-Firely Luciferase和pSPBT轉入到U87MG中，通過嘌呤霉素篩選出穩定表達熒光素酶的細胞株，并通過流式細胞儀選取高純度的U87MG-FLUC細胞。得到的細胞株能穩定表達熒光素酶，且其表達量及強度不會隨著細胞傳代而衰減。進一步建立的裸鼠顱內植瘤模型，則通過對實驗裸鼠正位和側位的拍攝確定了瘤體在顱內目標位置形成，有較強的生物熒光信號。本實驗可以延長裸鼠顱內成瘤的觀察時間及裸鼠荷瘤的生存期。

目前研究中活體動物體內光學成像技術多應用近紅外iRFP和GFP蛋白來成像，但是對于腦膠質瘤這種成瘤位置較深、能植入細胞懸液體積較少的瘤體模型來說，熒光素酶成像更加靈敏，是更為合適的選擇。