變溫控制策略促進地衣芽胞桿菌合成桿菌肽

宋 昭，戴 航，黃雪松，陳 雄，陳守文，李俊輝，王 志

(1 湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業發酵協同創新中心，湖北省工業微生物重點實驗室，湖北 武漢 430068；2 湖北大學省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室，湖北 武漢 430062;3 綠康生化股份有限公司，福建 浦城 353400)

地衣芽胞桿菌是一種常見的G+兼性厭氧菌[1]，可代謝合成部分多肽類抗生素[2]。桿菌肽是一種帶有噻唑環的多肽復合物，一般利用非核糖體合成酶系以Orn、Cys、Ile等12個氨基酸為反應前體進行合成[3-5]。其在國內主要通過發酵方式獲得[6]，通常在次級代謝過程中大量合成，而菌體一般在指數生長期結束或平穩期才進入次級代謝過程[7]。桿菌肽發酵期間伴有碳分解代謝物阻遏現象(CCR)，即作為速效碳源被消耗的葡萄糖，會阻止其他碳源的吸收[8-10]，利用一定量葡萄糖后菌體生長速率減慢，繼而由生長轉向次級代謝階段合成產物[11-12]。但大量的葡萄糖會誘發菌株發酵期間產生CCR效應，以及產生乙酸等初級代謝副產物[13]，進而抑制次級代謝產物-桿菌肽的合成[14-16]。另外，枯草芽胞桿菌中阻遏gapB和pckA的調控因子CcpN[17]的敲除，使糖異生途徑在對數期運轉[18]，細胞的生長速率降低了一半[19]。同時，敲除地衣芽胞桿菌ccpN能供應更多NADPH[17,20]，效價合成效率提高16.06%[21]。因此，效價合成效率與細胞生長速率之間有著緊密的聯系。而細胞的生長效率涉及營養和環境條件的綜合作用，其中，發酵溫度是關鍵因素之一。

基于以上分析，本文研究了變溫控制策略對地衣芽胞桿菌生長、代謝和桿菌肽合成效率的影響，建立了有效的變溫發酵策略以提高效價。

1 材料與方法

1.1 菌株

地衣芽胞桿菌DW2(BacilluslicheniformisDW2，DW2菌株)，湖北大學綠康生物工程研究所提供。

1.2 培養基

茄子瓶斜面培養基：酵母浸膏20 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，調pH 7.5，每個茄子瓶裝入60 mL。

種子培養基：豆粕30 g/L，玉米淀粉20 g/L，輕質碳酸鈣2 g/L，(NH4)2SO41 g/L，每個250 mL搖瓶裝入50 mL。

發酵培養基：豆粕50 g/L，玉米淀粉30 g/L，蛋白胨5 g/L，輕質碳酸鈣3 g/L，硫酸銨0.75 g/L。

1.3 培養方法

1.3.1 種子活化用無菌接種環刮取-80℃甘油管中的菌液，均勻涂抹至茄子瓶后，37℃培養24 h。

1.3.2 種子培養準備好無菌竹簽和50 mL水，用竹簽和水刮洗長滿菌苔的茄子瓶后將菌懸液轉入滅菌的250 mL搖瓶，接種量8%，即將4 mL菌懸液接于種子瓶中(接種后50 mL)。37℃、250 r/min培養24 h，得到種子液。

1.3.3 20L發酵罐培養20 L罐上接種量為5%(接種后10 L)，在通風量1.0 m3/h、溫度37℃、罐壓0.03 MPa、轉速500 r/min條件下發酵培養。

1.3.4 20L罐發酵策略控制發酵1：發酵溫度為37℃，以發酵培養基進行培養;發酵2：發酵溫度35.5℃，其他保持不變;發酵3：發酵溫度34℃，其他保持不變；發酵4：發酵溫度32.5℃，其他保持不變；發酵5：發酵溫度31℃，其他保持不變；發酵6：階段變溫實驗A，0-18 h設定在37℃，18-30 h設定在34℃；發酵7：階段變溫實驗B，0-18 h設定在34℃，18-30 h設定在37℃。

1.4 分析方法

1.4.1 葡萄糖的測定DNS法測定葡萄糖的含量[22]。

1.4.2 桿菌肽效價測定使用Ultimate 3000高效液相色譜測量桿菌肽效價[16]，桿菌肽標品68.5 U/mg。

1.4.3 生物量的測定取發酵液進行平板稀釋涂布，得到CFU/mL結果。

1.4.4 數據處理數據結果為最少3組平行試驗的均值，通過origin 9.0對數據作圖分析。

2 結果與分析

2.1 37℃對DW2菌體生長和效價合成的影響

在37℃發酵培養條件下，21 h之前處于指數生長期，生物量增長迅猛，并在21 h到達最高點(110×108CFU/mL)后自溶，18 h取樣pH為7.61，之后一直處于上升的趨勢，至30 h發酵結束放罐pH為8.84。18 h桿菌肽效價為790 U/mL，21 h到達效價最高點(952 U/mL)，平均效價合成速率為45.33 U/(mL·h)。效價維持穩定6 h后開始降解。18 h殘留還原糖8 g/L，18～21 h還原糖基本耗完，后期還原糖平穩保持在3 g/L左右，平均糖耗速率為1.9 g/(L·h)。

(a)菌體生長

2.2 35.5℃對DW2菌體生長和效價合成的影響

敲除糖異生途徑調控因子CcpN對菌體生長和桿菌肽合成的影響[19]，由此可以看出桿菌肽的合成效率與細胞生長速率有緊密的聯系。而細胞的生長效率涉及營養和環境條件的綜合作用，其中，發酵溫度是關鍵因素之一。因此，為了降低生長速率和糖耗速率，考慮調低溫度進行發酵培養，形成發酵策略2。35.5℃培養條件下的發酵過程相關參數變化如圖2所示。

(a)菌體生長

35.5℃發酵條件下生物量在21 h到達最高點(102×108CFU/mL)，只有發酵1生物量最高點的93%，21 h后菌體發生了自溶。18 h取樣pH為7.48，一直上升至30 h發酵結束放罐pH為8.47，各取樣點的pH值都低于發酵1。18 h殘留還原糖11.37 g/L，比發酵1多出42%，即降溫降低了糖耗速率，18～28 h期間，還原糖基本耗完，平均糖耗速率為1.43 g/(L·h)。另外，18～21 h是效價合成效率最高的階段，18 h效價為557 U/mL，低于發酵1的起步效價，到達效價最高點時間比發酵1推遲了8 h，29 h效價最高點為1014 U/mL，比發酵1提高了5.4%，最終發酵2的平均效價合成速率只有34.97 U/(mL·h)。說明通過降溫會降低效價合成效率，但是延長了效價的合成時間，因此最終效價提高了5.4%。

2.3 34℃對DW2菌體生長和效價合成的影響

降溫至35.5℃發酵提高了效價，因而考察了進一步降低發酵溫度至34℃對有關發酵參數的影響(圖3)。

(a)菌體生長

在34℃發酵條件下，菌體生長周期和之前保持一致，pH也一直處于上升趨勢，18h的pH為7.63，發酵結束時pH為8.11，pH增長趨勢比發酵1和2緩慢，21 h到達生物量最高點(98×108CFU/mL)，比發酵2生物量降低3.9%，21 h后菌體仍然自溶。18h還原糖濃度15.58g/L，比發酵2還原糖多出37%，平均糖耗速率為1.4g/(L·h)。說明：降溫34℃培養進一步減少了糖耗和生長速率。同時，18h的效價為503U/mL，比發酵2降低了9.7%，但18～27 h維持效價平穩增長，27～29 h的效價合成效率甚至更高，到29 h效價最高點1092 U/mL。由于此時pH處于堿性且菌體持續自溶，不利于繼續合成效價，另外，還原糖數據顯示在28-29 h碳源已然供應不足，說明之后桿菌肽合成缺乏能量供應，故未檢測30 h樣品，雖未出現效價拐點，但結合碳源消耗和菌體自溶情況可知，34℃培養29 h已接近效價最最高點，平均效價合成速率為37.66 U/(mL·h)，發酵期間效價合成速率穩定持久。降溫培養降低了對數期的糖耗和生長速率，有利于后期桿菌肽的合成，最終對比發酵2提高了7.7%。

2.4 32.5℃對DW2菌體生長和效價合成的影響

34℃培養條件下，效價最高點相比35.5℃又有了進一步的提高，因此，繼續考察了32.5℃發酵條件對發酵期間相關參數的影響(圖4)。

(a)菌體生長

在32.5℃發酵溫度下，pH變化趨勢與發酵3一致，21 h起步pH比發酵3較高，31 h放罐pH為8.15，pH增長速率比發酵3低。發酵21 h生物量到達最高點(92×108CFU/mL)，比發酵3生物量降低6.1%，21 h之后菌體自溶；21 h還殘留還原糖12.2 g/L，比發酵3的21h殘糖多出16.6%；21～31 h期間，還原糖基本耗完，平均糖耗速率為1.29 g/(L·h)。桿菌肽效價在21～28 h還是保持增長，在28 h到達最高點995 U/mL，效價雖然比發酵1只提高3.4%，與發酵2、3的結果相比卻降低了1.9%和8.9%，平均效價合成速率為35.54 U/(mL·h)，說明進一步降溫雖然降低了糖耗和生長速率、延長了桿菌肽合成時長，但同樣影響了桿菌肽合成效率。

2.5 31℃對DW2菌體生長和效價合成的影響

為了確證繼續降溫批發酵會進一步降低桿菌肽效價合成效率，考察31℃批發酵條件下有關發酵參數的影響(圖4)。

(a)菌體生長

在31℃發酵條件下，菌體肽生長周期明顯延長，pH增長趨勢和發酵4一致，差異不大。菌體21～24 h處在對數生長期，生物量在24 h到達最高點82×108CFU/mL，比發酵4生物量降低了10.87%，之后依然存在自溶現象。效價在生長期至自溶期保持了穩定的增長速率，21 h起步效價381 U/mL，29 h到達最高點735 U/mL，比發酵4降低了26.1%。21 h還殘留還原糖17.4 g/L，比發酵4的殘糖多出42.4%，直到發酵結束31 h還有還原糖6.5 g/L，平均糖耗速率為1.2 g/(L·h)，平均效價合成速率僅為25.34 U/(mL·h)。因此，34℃培養是桿菌肽的合成最適條件。

2.6 階段變溫A對DW2菌體生長和效價合成的影響

對比發酵策略1的結果發現，在34℃發酵條件下，單位菌體桿菌肽合成速率最高，效價比對照(發酵1)提高了13.5%；隨著發酵溫度的降低，糖耗速率也逐漸降低，生物量也逐漸減少。考慮到前期主要是菌體生長繁殖，桿菌肽主要是中后期次級代謝合成，嘗試0-18h溫度控制在37℃，18 h至發酵結束控制在34℃，以此降低生長速率，減少糖耗，使更多的碳、氮源用于合成桿菌肽，形成了發酵策略6。發酵過程中有關發酵參數的變化如圖6所示。

階段變溫實驗A中，18 h起步pH為7.82，發酵期間依舊上升，31 h放罐pH為8.80。效價在24 h到達最高點903 U/mL，比發酵1降低了6%，比發酵3降低了17.3%。生物量在21 h到達最高點106×108CFU/mL，比發酵1生物量最高點少3.6%，比發酵3生物量最高點多8.2%，21-31 h后菌體一直自溶。18 h殘糖為10.78 g，比發酵3殘糖少30.8%，但比發酵1殘糖多34.75%，這是由于滅罐過程產生碳源損耗不同，或裝液量差異使攪拌傳質效果不一樣產生的糖耗差異，發酵6在0-18 h、18-21 h的糖耗速率為1.85、0.55 g/L，而發酵1在0-18 h、18-21 h的糖耗速率為2、1.55 g/L，即18 h降溫能有效降低糖耗速率，延緩碳源利用。18-27 h期間，還原糖基本耗完；27 h后還原糖一直在3 g/L左右低位維持，平均糖耗速率為1.5 g/(L·h)，平均效價合成速率為37.61 U/(mL·h)。發酵1結果說明37℃培養時耗糖最快，同時效價合成效率最高，降溫雖能降低糖耗，但對比發酵1發現4次降溫都會使效價合成速率降低，而發酵6在18 h的殘糖稍多于發酵1，且后續降溫成功延緩碳源消耗，從而延長效價合成時間，但效價合成速率的降低帶來影響更大，因此效價最高點只有發酵1的94%；與發酵3相比，則是發酵前期糖耗較多，留給中后期次級代謝過程中可利用的碳源較少，桿菌肽合成所需能量不夠，故發酵6效價最高點只有發酵3的83%。

(a)菌體生長

2.7 階段變溫B對DW2菌體生長和效價合成的影響

由發酵策略3得到啟發，嘗試在細胞生長階段降低溫度減少糖耗，以使更多的碳源用于次級代謝過程。采用了0-18 h控制在34℃培養，18 h至發酵過程結束控制在37℃，形成了發酵策略7，發酵過程中有關發酵參數的變化如圖7所示。

階段變溫實驗B中，18 h起步pH為7.25，上升至29 h(放罐)的pH為8.35，同期pH都低于發酵6。生物量在21 h到達最高點103×108CFU/mL，比發酵1生物量最高點少6.4%，比發酵3生物量最高點多5.1%。18 h還原糖16.7 g/L，是發酵1殘糖量的2倍多，比發酵3殘糖多7.2%；18-27 h期間，還原糖基本耗完，平均糖耗速率為1.39 g/(L·h)。18 h前后分別34℃和37℃培養的發酵策略，使菌體前期不至于生長迅速，耗糖過快，18 h菌體生物量為63×108CFU/mL，和發酵3的18 h生物量(65×108CFU/mL)相差不大，但比發酵1的18 h生物量減少12.5%。后續升溫至37℃后，效價在29 h到達最高點1193 U/mL，比發酵1提高了24%，比發酵3提高了9.2%。平均效價合成速率為41.14 U/(mL·h)。

(a)菌體生長

發酵1～7相關參數見表1。

表1 所有試驗批次相關參數情況

表1中：效價是發酵期間效價最高點數據，生物量是發酵期間生物量最高點數據；生長速率是最高生物量與時間的比值，葡萄糖消耗速率是葡萄糖消耗量與時間的比值，平均效價合成速率是效價到達最高點與時間的比值。發酵7的效價最高，比發酵1和3分別提高了24%和9.2%，而平均效價合成速率僅低于發酵1。發酵3效價僅低于發酵7，說明適當降溫可以減緩生長速率，延長桿菌肽合成時間，提高桿菌肽產量。發酵6和7對效價合成的影響表明變溫控制策略可有效提高效價。

3 結論

DW2菌株發酵產桿菌肽過程中，菌體前期生長和初級代謝強度會影響中后期次級代謝產物-桿菌肽的合成效率。本文研究了降溫和變溫控制對菌體生長速率、糖耗速率和效價合成的影響，其結論如下：

1)降低發酵溫度會明顯減少糖耗速率和生長速率，延長桿菌肽合成時間來提高產量，34℃發酵溫度下的效價最高點比37℃提高了13.5%，到達了1092 U/mL。

2)18 h前后分別34℃和37℃培養的階段變溫策略滿足了桿菌肽合成對細胞數量，能量供應(中后期糖含量)和前體的需求，效價比對照(37℃培養)提高了24%，比34℃培養提高了9.2%，效價在29 h到達了最高點(1193 U/mL)。

該策略便于工藝控制，可以為工業生產提供重要參考。