油用蘿卜籽中黃酮提取工藝優化

朱涵彬，李 靚，董麗鑫

(河南牧業經濟學院食品與生物工程學院，河南 鄭州450046)

0 引言

蘿卜是一種普通的蔬菜，在全國各地均有栽培，蘿卜籽是蘿卜的成熟種子，別名萊菔子、蘿白子和菜頭子等，形狀呈卵圓形或橢圓形，略扁，表面顏色為黃棕色、紅棕色或灰褐色，具有食用價值和藥用價值，但并沒有得到良好的應用[1]。隨著對油料資源的開發，人們逐漸開始重視油用蘿卜籽的有效成分研究。近年來有研究表明，蘿卜籽粕中含有較為豐富的黃酮類化合物，黃酮是存在于大多數植物體內的一種天然化合物，含有2-苯基色酮結構[2-4]。黃酮類化合物分子式中含有酮式羰基，第1位上的氧原子具堿性，故俗稱黃堿素或黃酮。黃酮類化合物因具有降壓、降血脂、抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化、抗血栓、抗病變、阻止細胞衰老、提高機體免疫力、維護心血管系統和保肝等藥理功能，具有很好的開發潛質，受到國內外學者的廣泛重視。因此，有必要對蘿卜籽中的黃酮化合物進行研究。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

油用蘿卜籽品名：超級白美濃；品質：一級；購于武漢市蔬菜科學研究所。蘆丁對照品購自合肥博美生物科技有限責任公司。無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉等提取用的溶劑均為國產分析純，均為天津市科密歐化學試劑有限公司產品。

主要儀器：DGG-9030A型鼓風干燥箱(鄭州南北儀器設備有限公司)；HR-08型多功能粉碎機(上海哈瑞斯電器有限公司)；FA1004T型分析天平(廈門雄發儀器儀表有限公司)；VGT-2013QTD型超聲波清洗器(250W，廣東固特超聲股份有限公司)；ROTINA380R型臺式大容量冷凍離心機(德祥科技有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1工藝流程

樣品→干燥→粉碎→稱取→浸泡→超聲波輔助提取→離心→稀釋→定容→樣品液→取樣測定。

1.2.2繪制蘆丁標準曲線

準確稱取20 mg蘆丁標準品，用60%乙醇溶解，并轉移至50 mL容量瓶中稀釋至刻度，得到蘆丁標準溶液的濃度為0.4 mgmL。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL蘆丁對照品溶液于25 mL比色管中，加水至10 mL。在6支比色管中分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，振蕩搖勻，放置6 min；再分別加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；最后各加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，加蒸餾水至刻度線，定容，振蕩搖勻后，放置15 min。以空白試劑為對照，在波長為510 nm處測定吸光度值。以標準品的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線[5]。

1.2.3制備樣品液

將50 g蘿卜籽放入干燥箱中，在100 ℃條件下干燥4 h，然后用粉碎機粉碎，過100目篩，待用。準確稱取1 g蘿卜籽粉末，置于250 mL錐形瓶中，按一定的料液比加入一定體積分數的乙醇溶液，振蕩搖勻，浸泡30 min，在一定溫度下，超聲提取一定時間后，取出錐形瓶，冷卻至室溫，再倒入離心管中，以8 000 rmin離心后，將上清液轉移至100 mL容量瓶中，用一定體積分數的乙醇溶液定容，即為樣品液[6]。

1.2.4單因素試驗

分別以料液比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時間為試驗因素，設置各因素的不同水平，進行單因素試驗，以確定試驗因素對蘿卜籽提取液中總黃酮提取率的影響。

(1)料液比對總黃酮提取率的影響。

設定乙醇濃度為70%，超聲溫度為55 ℃，超聲時間為30 min，分別以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35 gmL的料液比量取相應的乙醇溶液于錐形瓶中。

(2)乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。

(3)超聲溫度對總黃酮提取率的影響。

(4)超聲時間對總黃酮提取率的影響。

1.2.5響應面試驗

以單因素試驗結果為基礎，根據Box-Behnken的中心組合設計原則，合理選擇因素水平，使用Design-Expert 8.0.6軟件設計4因素3水平的試驗[7]。

1.2.6測定總黃酮得率

精密吸取5 mL樣品液，于25 mL比色管中，按1.2.2方法處理測定，用線性回歸方程測定1 g樣品中總黃酮的濃度，再用式(1)計算1 g樣品中總黃酮得率。

w=cnvm

(1)

式中w——總黃酮得率，mgg

c——樣品溶液中黃酮類化合物的質量濃度，mgmL

n——稀釋倍數

v——樣品液的體積，mL

m——樣品質量，g

2 結果與分析

2.1蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線如圖1所示。

2.2單因素試驗

2.2.1料液比對總黃酮提取率的影響

料液比對總黃酮提取率的影響如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著料液比的增加，蘿卜籽中黃酮類化合物的提取量先增加后減少。當料液比小于1∶25 gmL時，黃酮含量隨料液比的增加而增大；當料液比為1∶25 gmL時，黃酮含量最高；當料液比大于1∶25 gmL時，黃酮含量逐漸降低。這可能是因為在一定料液比范圍內，增加料液比有利于增加活性成分與溶劑的接觸機會，擴大組織體系中的濃度差，活性成分更容易溶解[8]。當料液比增加到一定量的時候，有效成分的溶解達到了一種動態平衡，乙醇溶液將黃酮基本溶解出來，提取含量不再增加。如果繼續增大料液比，可能會使一些醇溶性物質溶解，從而干擾黃酮提取含量的測定，導致黃酮含量下降，并且造成試劑的浪費。因此最佳的料液比為1∶25 gmL。

2.2.2乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對總黃酮提取率的影響如圖3所示。

從圖3可以看出，在一定乙醇濃度范圍內，蘿卜籽中黃酮類化合物的含量隨乙醇濃度的增加先升高后降低。當乙醇濃度<70%時，提取量隨乙醇體積分數的增大而增加；當乙醇濃度為70%時，提取量最高；當乙醇濃度>70%時，提取量減少。這可能是因為在一定的溶劑濃度范圍內，溶劑濃度的增加有利于溶劑與原料的充分接觸，使黃酮類化合物的含量增加。當達到一定濃度，黃酮的含量達到最高；再增加溶劑濃度，導致干擾性雜質溶出，對黃酮含量的測定造成影響。因此乙醇的最佳濃度為70%。

2.2.3超聲溫度對總黃酮提取率的影響

超聲溫度對總黃酮提取率的影響如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著超聲溫度的升高黃酮類化合物的含量先升高后降低。當超聲溫度<55 ℃時，黃酮含量隨溫度升高而增加；當超聲溫度達到55 ℃時，黃酮含量最高；當超聲溫度>55 ℃時，黃酮含量減少。這可能是因為一定溫度范圍內，溫度越高，分子運動速率越快，使體系內反應速率加快，溶液擴散、滲透和溶解地較為徹底，黃酮類化合物更容易從細胞中轉入到溶劑中。但是當溫度上升到一定程度的時候，一些黃酮類化合物可能會降解和破壞，從而導致含量下降。因此，最佳超聲溫度為55 ℃。

2.2.4超聲時間對總黃酮提取率的影響

超聲時間對總黃酮提取率的影響如圖5所示。

由圖5可知，隨著超聲時間的增加，黃酮含量先增加后減少。當超聲時間<30 min時，黃酮含量隨超聲時間增加而增加；當超聲時間為30 min時，黃酮含量最高；當超聲時間>30 min時，黃酮含量略有下降。這可能是因為超聲時間越長對黃酮類化合物的溶解越有利，但當時間長到一定程度，再延長時間，超聲產生的空化效應和振動作用，會導致黃酮化合物的降解，測定含量偏低。因此，最佳超聲時間為30 min。

2.3響應面優化試驗設計及結果分析

2.3.1響應面優化試驗設計

根據單因素試驗結果，響應面試驗因素和水平如表1所示。響應面設計及結果如表2所示。

表1 響應面試驗因素和水平表

表2 響應面設計及結果

2.3.2數據模型的建立及回歸方程的方差分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的數據進行二次多元擬合處理后，得到回歸方程為

黃酮總量=15.00+0.24A+0.10B-0.53C-0.35D+0.65AB+0.62AC+0.14AD+0.32BC+0.48BD-0.10CD-1.04A2-2.20B2-0.61C2-0.71D2

(2)

式中A——料液比，gmL

B——乙醇濃度， %

C——超聲溫度， ℃

D——超聲時間， min

所得的方差分析如表3所示。

表3 方差分析

根據表3，模型F=9.30，P<0.000 1，表明二次回歸方程模型極顯著[9]。失擬項F=1.19，P=0.468 9，不顯著，說明二次回歸方程擬合度較高，用于計算結果是有意義的。

表3中，二次項A2和B2，P<0.001，極顯著；C和D2，P<0.01，高度顯著；AB、C2顯著。通過響應面分析得出對黃酮提取含量影響的大小順序為超聲溫度>超聲時間>料液比>乙醇濃度。

使用Design-Expert 8.0.6軟件對數據進行分析得出，料液比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時間4個因素之間兩兩相互作用對黃酮提取含量影響情況，如圖6～11所示。

2.3.3最佳工藝檢驗

油用蘿卜籽中總黃酮提取工藝的最佳條件：超聲溫度53 ℃，超聲時間28 min，料液比為1∶25 gmL，乙醇濃度為70%，此時提取率最高，蘿卜籽中總黃酮的提取含量為15.15 mgg。

經過3組平行試驗，證明應用上述最佳提取工藝條件，實際油用蘿卜籽中總黃酮的平均提取含量為15.18 mgg，與軟件預測值接近，證明最佳工藝預測值較準確[10-11]。

3 結論

通過分析料液比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時間4個因素及兩兩因素間對總黃酮提取含量的影響，得出各因素對提取含量影響大小的順序為超聲溫度>超聲時間>料液比>乙醇濃度。當料液比1∶25 gmL，乙醇濃度70%，超聲溫度53 ℃，超聲時間28 min時，提取率最高，此時總黃酮含量為15.18 mgg，與模型預測值15.15 mgg接近，表明此工藝較為可靠，有一定的參考價值。