藍莓酶解工藝優化研究

戴意強 吳寒 單成俊 劉小莉 王英 臧泉 周劍忠 夏秀東

摘要：為提高藍莓出汁率和果汁中花色苷含量，以酶的種類、酶解時間、酶解溫度和酶的添加量為對象，研究其對藍莓出汁率和花色苷含量的影響。通過單因素試驗研究藍莓出汁率和花色苷含量對各因素的依賴關系，并采用響應曲面法進行優化，結果表明，提高藍莓出汁率和花色苷含量的最佳工藝為酶解時間3 h，酶解溫度 54.5 ℃，酶的添加量4.8‰，在此條件下藍莓出汁率和花色苷含量分別為70.95%和44.94 mg/L。

關鍵詞：藍莓;出汁率;花色苷含量;響應曲面;酶解工藝

中圖分類號： TS255.36 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0219-06

藍莓（Vaccinium uliginosum）屬于杜鵑花科越橘屬，原產于北美和歐洲地區[1]。藍莓被稱為“長壽水果”，具有很強的抗氧化能力，可以清除自由基，被人們認為是所有水果和蔬菜中抗氧化劑的最大來源之一[2]。藍莓果實含有豐富的蛋白質、食物纖維、糖分、維生素、礦物質、花色苷等[3]。在常見含有花色苷的果蔬中，藍莓花色苷含量最高[4]，具有抗氧化、保護視力、預防治療癌癥、預防心腦血管疾病和提高記憶力等功能[5-10]。

藍莓的成熟正值夏季，且生產時間集中，果實不耐儲藏，因此常常被加工成果汁、果酒、果醬等制品。目前的果蔬加工業中，常常會加入酶類以提高果蔬汁的出汁率及內容物的溶出，其中應用最廣泛的是添加果膠酶[11]。現有的研究普遍使用單一酶加入到果蔬中或者僅僅將出汁率作為指標進行試驗，本試驗利用果膠酶和纖維素酶對藍莓進行酶解，以出汁率和花色苷含量作為評價指標，通過單因素試驗和響應曲面優化，確定最佳的藍莓汁生產工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藍莓來源于南京市溧水區白馬種植基地;果膠酶（≥40 units/mg solid）和纖維素酶（≥50 units/mg solid）購于上海藍季生物公司。

1.2 試劑與儀器

試劑：KCl，國藥集團化學試劑有限公司生產;NaAc，南京化學試劑股份有限公司生產。

儀器：離心機3K15，SIGMA生產;數顯恒溫水浴鍋HH-4，國華電器有限公司生產;破壁多功能料理機，愛納福電器有限公司生產;酶標儀Epoch，美國伯騰儀器有限公司生產。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓汁的制作工藝 藍莓→清洗→瀝干→破碎打漿→加酶→保溫酶解→離心（5 000 r/min，15 min）→收集上清→成品。

1.3.2 藍莓酶解單因素試驗 （1）酶的種類對藍莓出汁率及花色苷的影響。果膠酶和纖維素酶按 1 ∶ 1 的比例添加，添加量為3‰，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為2 h，考察酶的種類（不添加酶，添加果膠酶，添加纖維素酶，添加果膠酶和纖維素酶）對藍莓出汁率及花色苷的影響。（2）酶的添加量對藍莓出汁率和花色苷含量的影響。添加果膠酶和纖維素酶，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為2 h，考察酶的添加量（1‰、2‰、3‰、4‰、5‰）對藍莓出汁率和花色苷含量的影響。（3）酶解溫度對藍莓出汁率和花色苷含量的影響。添加果膠酶和纖維素酶，酶的添加量為3‰，酶解時間為2 h，考察酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）對藍莓出汁率和花色苷含量的影響。（4）酶解時間對藍莓出汁率和花色苷含量的影響。添加果膠酶和纖維素酶，酶的添加量為3‰，酶解溫度為50 ℃，考察酶解時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對藍莓出汁率和花色苷含量的影響。

1.3.3 酶解效果指標的測定 （1）出汁率的測定：分別稱取藍莓果漿和離心后收集的上清液，按以下公式計算出汁率：出汁率=上清液質量/藍莓果漿質量×100%。（2）花色苷的測定：參照蘭永麗的報道方法[12]進行測定。取2份同一試樣0.1 mL，分別加入0.2 mol/L的KCl（pH值1.0）和0.2 mol/L的NaAc（pH值4.5）0.9 mL，靜止平衡1 h后，分別測定樣品在510 nm和700 nm處的吸光度。花色苷含量計算公式：花青素含量=ΔD×MM×D×1 000/ε。式中：ΔD代表[（D510 nm-D700 nm）pH1.0-（D510 nm-D700 nm）pH4.5]，mg/L;MM代表矢車菊素-3-葡萄糖苷分子質量449.2;D代表稀釋倍數;ε代表矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數26 900。

1.3.4 響應曲面優化試驗設計 由單因素試驗結果，依據Box-Behnken設計原理，以藍莓出汁率和花色苷含量為響應值，選取酶的添加量、酶解溫度、酶解時間設計響應曲面試驗，優化藍莓汁制作的工藝參數，試驗因素及水平見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶的種類對藍莓果漿出汁率及花色苷含量的影響 藍莓果實的細胞間層和細胞壁之間存在著果膠，果膠會影響、阻礙藍莓中有效成分的釋放[13]，而果膠酶的加入可以使藍莓渣中果膠物質進一步分解，提高出汁率和促進花色苷等物質的釋放。木質纖維素生物質能抵抗微生物破壞和一些物理化學損傷，纖維素酶可以破壞木質纖維素生物質結構，使得內容物流出[14-15]。由圖1可知，與不添加酶相比，單獨添加一種酶后的藍莓出汁率無顯著增加，但果膠酶和纖維素酶聯合作用的藍莓出汁率顯著增加（P<0.05）。與不添加酶相比，通過添加果膠酶和纖維素酶，藍莓汁的花色苷含量顯著增加（P<0.05），這是因為果膠酶和纖維素酶使藍莓果膠和纖維素等物質水解，進而有效成分如花色苷充分溶出，且花色苷的含量與產品的顏色呈正相關[16]，有助于增強消費者的認同感。果膠酶和纖維素酶共同加入的藍莓出汁率和花色苷含量分別為63.45%和41.94 mg/L。因此選擇藍莓中添加果膠酶和纖維素酶有助于出汁率和花色苷含量的提高。

2.1.2 酶解時間對藍莓出汁率和花色苷含量的影響 由圖2可見，隨著酶解時間的增加，藍莓的出汁率和花色苷含量先持續增加后趨于平穩。酶的作用促使藍莓果肉組織和細胞壁結構發生了破壞，當酶解時間為2.5 h時，出汁率和花色苷含量均達到最大值，分別為65.27%和41.90 mg/L，此時藍莓內容物已基本溶出。

2.1.3 酶解溫度對藍莓出汁率和花色苷含量的影響 酶的最適溫度不僅能保持酶自身的熱穩定性和維持自身結構穩定性，還能通過影響酶活性位點的親和力來影響酶的活性。由圖3可知，當溫度從40 ℃上升至55 ℃時，藍莓的出汁率和花色苷含量顯著上升（P<0.05）;當酶解溫度為55 ℃時，藍莓出汁率和花色苷含量分別為 65.45% 和 43.31 mg/L，相較于40 ℃時藍莓的出汁率和花色苷含量，分別上升了7.44%和13.24%。當溫度上升至60 ℃時，藍莓出汁率顯著降低（P<0.05），但藍莓汁中花色苷含量保持平穩，這是因為溫度上升影響了果膠酶和纖維素酶的活性，而適當的溫度可以提高花色苷的溶出率，抑制過氧化物酶、多酚氧化酶等可以降解花色苷的酶的活性。

2.1.4 酶的添加量對藍莓出汁率和花色苷含量的影響 將果膠酶和纖維素酶按1 ∶ 1的比例添加到藍莓果漿中，其對藍莓果汁出汁率和花色苷含量的影響如圖4所示。適當的酶添加不僅可以提高藍莓的出汁率，而且還可以釋放結合態花色苷，提高藍莓汁的顏色和抗氧化程度。隨著酶添加量的增加，藍莓的出汁率和花色苷含量先增加后趨于平穩，這與張曉旭等的研究結果[17]一致。當酶的添加量為4‰時，藍莓果漿的出汁率和花色苷含量分別為64.33%和41.11 mg/L。選擇酶的添加量為4‰時，既可以保證產品的得率和品質，又可以減少生產成本。

2.2 響應曲面試驗結果分析

2.2.1 響應曲面試驗結果 在單因素的基礎上，向藍莓汁的制作過程中添加果膠酶和纖維素酶，以藍莓的出汁率（Y1）和藍莓汁花色苷含量（Y2）作為試驗設計的響應值，酶的添加量（A）、酶解溫度（B）和酶解時間（C）為自變量，設計響應曲面試驗，結果見表2。對表2的試驗數據進行多元回歸擬合，得到藍莓出汁率和花色苷含量的二次多項回歸方程為式（1）和式（2），其中Y1為出汁率，Y2是花色苷含量，A為酶解時間，B為酶解溫度，C為酶的添加量。

2.2.2 響應曲面方差分析 模型的方差分析見表3和表4。P值大小衡量了模型的各個因素的顯著性水平。由表3可知，P<0.01，表明關于出汁率的模型高度顯著，F值為41.63，也表明二次模型高度顯著。在模型中，一次項A和二次項A2、B2影響顯著。失擬值為0.87，在α=0.01或α=0.05下不顯著，因變量和全體自變量之間的線性關系極顯著（R2=0.98）。由表4可知，P<0.05，表明關于花色苷含量的模型顯著，F值為6.51，也表明二次模型顯著。在模型中，一次項B和二次項B2以及交叉項AB為影響顯著。失擬值為1.46，在α=0.01或α=0.05下不顯著，因變量和全體自變量之間的線性關系顯著（R2=0.89）。

通過方差分析，結合3個因素的平方值可以得到3個因素對出汁率的影響次序為酶解時間>酶的添加量>酶解溫度，而3個因素對花色苷含量的影響次序為酶解溫度>酶解時間>酶的添加量。

2.2.3 響應曲面交互作用分析 響應曲面（等高線圖和3D圖）可以直觀地反應試驗中不同因素對藍莓出汁率和藍莓花色苷含量的影響，以及兩兩因素之間交互作用對藍莓出汁率和花色苷含量的影響。各因素之間的交互作用對藍莓出汁率和花色苷含量如圖5至圖10所示。

由圖5至圖7等高線圖可知，酶的添加量為4‰時，酶解時間一定，藍莓的出汁率隨著酶解溫度的升高呈現先增加后降低的趨勢;酶解溫度為55 ℃時，酶解時間一定，藍莓出汁率隨酶的添加量的增加而上升;酶解時間為2.5 h時，酶解溫度一定，藍莓的出汁率隨酶的添加量的增加而上升。由圖5至圖7的3D曲面平滑程度可知，酶解時間和酶解溫度、酶解時間和酶的添加量、酶解溫度和酶的添加量兩因素的交互作用不明顯。

由圖8至圖10等高線圖可知，酶的添加量為4‰時，酶解時間一定時，藍莓汁的花色苷含量隨酶解溫度的上升呈現先上升后降低的趨勢;酶解溫度為55 ℃時，酶解時間一定時，藍莓汁的花色苷含量隨酶的添加量的增加呈現上升趨勢;酶解時間為2.5 h時，當酶解溫度一定時，藍莓汁的花色苷含量隨酶的添加量的增加呈現上升趨勢。由圖8至圖10的3D曲面陡峭程度可知，酶解時間和酶解溫度兩因素交互作用明顯，酶解時間和酶的添加量、酶解溫度和酶的添加量兩因素的交互作用不明顯。

2.2.4 模型驗證試驗 通過 Design Expert 中心組合法的優化分析可得最高出汁率和花色苷含量條件分別為酶解時間3 h、酶解溫度54.67 ℃、酶的添加量4.86‰和酶解時間3 h、酶解溫度54.41 ℃、酶的添加量5‰。考慮到生產工藝和生產成本，選取條件為酶解時間3 h、酶解溫度54.5 ℃、酶的添加量4.8‰。進行3次平行試驗，其藍莓出汁率和花色苷含量分別為70.95%和44.94 mg/L，與預測值（70.27%和44.58 mg/L）相比，相對誤差分別為0.95%和0.80%，說明該響應面模型與實際擬合結果較好，該模型可靠。

3 結論

本試驗在單因素的基礎上，根據Box-Benhnken設計相應曲面試驗，建立了藍莓出汁率和花色苷含量的二次多項式回歸模型，優化藍莓出汁和花色苷提取的工藝參數。本試驗模型擬合程度高，能夠對反應進行預測，模型方差分析中，模型P<0.05，表明該模型顯著。模型給出的最優工藝參數為酶解時間3 h、酶解溫度54.5 ℃、酶的添加量4.8‰，該條件下藍莓出汁率和花色苷含量分別為70.95%和44.94 mg/L。

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