超高效液相色譜-串聯質譜法測定馬鈴薯中唑菌酮、氰霜唑及其代謝物CCIM的殘留量

周悅 孫慧 李欣 王遠 王洪慶 龍驚驚 丁琦 張璋

摘要：采用超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定馬鈴薯中唑菌酮、氰霜唑及其代謝物CCIM的含量，樣品經含0.1%乙酸的乙腈溶液振蕩提取，離心過濾后上機檢測。結果顯示，唑菌酮在0.002 0 mg/L～0.100 0 mg/L的濃度之間線性關系良好，r2≥0.998 6;氰霜唑及其代謝物CCIM在0.000 2 mg/L～0.010 0 mg/L的濃度之間線性關系良好，r2≥0.996 8。上述農藥在馬鈴薯中的平均回收率在76.4%～95.9%之間，相對標準偏差（RSD）在0.91%～5.62%之間，定量限在0.01～0.02 mg/kg之間。該方法簡單、快速、準確性好、靈敏度高，能夠滿足馬鈴薯中唑菌酮、氰霜唑及其代謝物CCIM殘留量的檢測要求。

關鍵詞：唑菌酮;氰霜唑;CCIM;馬鈴薯;超高效液相色譜-串聯質譜法

中圖分類號： S482.2;S481+.8 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0206-04

唑菌酮是一種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，對防治各種霜霉病、黑斑病、晚疫病效果顯著[1-3]。氰霜唑是一種新型環境保護型的苯并磺胺咪唑類殺菌劑，對疫霉菌、腐霉菌等卵菌綱病原菌具有很高的活性[4-5]。由于氰霜唑在與其他殺菌劑共同施用時，具有無交叉抗性的特點，可以與唑菌酮制成混劑，這種混劑對于治療馬鈴薯晚疫病和霜霉病效果顯著[6]。在2014—2018年間，唑菌酮和氰霜唑分別作為有效成分以不同劑型在我國馬鈴薯病蟲草害防治上登記的數量分別為7、23個[7]。然而，氰霜唑在使用后會迅速分解成4-氯-5-（4-甲苯基）-1H-咪唑-2-腈（CCIM）、4-氯-5-（4- 甲苯基）-1H-咪唑-2-羧酸（CCTA）、4-氯-5（4-甲苯基）-1H-咪唑-2-甲酰胺（CCIM-AM）等多個代謝產物。其中CCIM作為主要降解產物，比氰霜唑具有更高的毒性[5]。

目前，國內外尚未有文獻報道能同時檢測馬鈴薯中唑菌酮、氰霜唑、CCIM殘留量的分析方法。本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法建立同時測定馬鈴薯中唑菌酮、氰霜唑及其代謝物CCIM含量的分析方法。在樣品前處理過程中，經過反復試驗、對比回收率，確立馬鈴薯樣品用含0.1%乙酸的乙腈振蕩提取，離心過濾后直接經UPLC-MS/MS檢測的方法，較傳統QuEChERS方法更加簡捷、經濟、高效。本研究方法在覆蓋2個數量級的線性范圍內[8]，線性關系良好，并得到較高的準確度和精密度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要的試驗儀器有PerkinElmer Qsight超高效液相色譜儀-串聯三重四級桿質譜儀（珀金埃爾默儀器有限公司）、梅特勒-托利多PB-10pH計、梅特勒-托利多XS205DU型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、美的WBL25B36榨汁機（美的公司）、Sigma 3K15高速冷凍離心機（日本Sigma公司）、ZWY-211C恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

主要的試驗試劑有哇哈哈純凈水，甲醇、乙腈（色譜級，美國Fisher公司），甲酸（色譜級，Acros Organics公司），乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），農藥標準品：氰霜唑、CCIM、唑菌酮[國家農藥質量監督檢驗中心（沈陽）]，N-丙基乙二胺（PSA）固相吸附劑40～60 μm、C18凈化劑（Agela Technologies）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 將標準溶液經乙腈逐級稀釋，配制成100、10、1 mg/L的標準溶液儲備液，將濃度為1 mg/L的儲備液分別用乙腈（含0.1%乙酸）和空白基質稀釋，唑菌酮配制成0.002 0、0.005 0、0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100 0 mg/L系列濃度的工作溶液;氰霜唑和CCIM配制成 0.000 2、0.000 5、0.001 0、0.002 0、0.005 0、0.010 0、0.020 0 mg/L系列濃度的混合工作溶液。

1.2.2 樣品前處理 采用改進后的QuEChERS方法：稱取（10±0.05） g經榨汁機攪碎后的馬鈴薯樣品置于三角瓶中，加入50 mL乙腈（含1%乙酸），180 r/min 振蕩30 min后，加入6 g氯化鈉振蕩 2 min，鹽析，以5 000 r/min的轉速離心5 min，取2.0 mL上層清液直接過3次0.22 μm的有機系濾膜，UPLC-MS/MS檢測。

1.2.3 儀器條件 色譜條件：色譜柱Phenomenex Kinetex 2.6 μm，C18（100 mm×4.6 mm），柱溫為 40 ℃，流速為0.6 mL/min，進樣量為10 μL，流動相為A相：水（含0.1%甲酸），B相：乙腈。洗脫條件見表1。

質譜條件：采用ESI電噴霧離子源，正離子模式，三重四級桿質量檢測器。離子化電壓為 5 800 V，離子源溫度為400 ℃，反吹干燥器流速為100 μL/min，霧化氣流速為180 μL/min，質譜接口加熱溫度HSID為300 ℃，真空室入口電壓為10 V，利用質譜自帶的多反應監測模式（multiple reaction monitoring，簡稱MRM）優化功能，獲得不同離子對的碰撞室入口電壓和碰撞能2個參數。3種農藥的定性/定量離子對如表2。

1.2.4 測定方法 按“1.2.3”節的儀器條件，待儀器基線穩定后，連續注入數針標樣溶液，直至相鄰2針峰面積相對變化小于1.5%后，采用標準曲線、測試樣品、標準曲線的順序進行測定。同時，作溶劑空白和基質空白對照，按照標準曲線的線性方程對測試樣品進行外標定量，色譜結果如圖1所示。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯樣品前處理方法的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇 分別選取乙腈、甲醇、乙腈+0.1%乙酸、甲醇+0.1%乙酸等4種溶劑進行提取，發現采用甲醇、甲醇+0.1%乙酸2種溶劑時，振蕩、鹽析后，分層不明顯，上層提取液混濁。采用乙腈作為提取溶劑時，氰霜唑、CCIM、唑菌酮的平均回收率分別為84.9%、87.2%、70.5%;用乙腈+0.1%乙酸作為提取溶劑，氰霜唑、CCIM、唑菌酮的平均回收率分別為88.4%、90.0%、76.2%，因此本研究選用乙腈+0.1%乙酸作為提取溶劑。

2.1.2 凈化劑的選擇 QuEChERS方法常用的凈化劑包括GCB、MgSO4、PSA、C18等吸附填料[9-11]，通常PSA用于去除極性的有機酸、一些糖類、脂類;MgSO4用于去除水分;GCB用于去除色素、如葉綠素，但對平面結構藥物會有吸附;C18用于去除脂類和固醇、類胡蘿卜素等。本研究分別考察PSA和C18組合添加、單獨添加、不添加對回收率的影響，結果發現，PSA和C18均對唑菌酮的回收率影響較大，回收率降低，懷疑與化合物分子結構有關[12-15]。而當不添加任何凈化劑時，氰霜唑、CCIM、唑菌酮均能得到較好的回收率，且目標物并未受到基質中雜質的干擾，具體參見圖2至圖4。因此，本研究采用鹽析分層后，不經凈化，采用直接過濾的方式進行UPLC-MS/MS檢測，此法更加經濟、快捷、高效。

2.2 方法的線性相關性、基質效應評價

分別以唑菌酮、氰霜唑、CCIM標液的質量濃度（mg/L）對響應值（峰面積）進行線性回歸，采用1/x2加權， 得出線性回歸方程。基質效應評價按照純溶劑標準溶液、基質標準溶液的順序進行檢測擬合標準曲線方程。其中，唑菌酮在純溶劑中的曲線方程為y=553.760 00x-191.996 17，r2=0.998 7（n=6）;在馬鈴薯基質中的曲線方程為y=467.000 00x-260.444 61，r2=0.998 6（n=6）;基質效應 ME%=（553.76-467.00）/553.76×100%=15.67%;氰霜唑在純溶劑中的曲線方程為y=9 930x-217，r2=0.999 2（n=7）;在馬鈴薯基質中的曲線方程為y=8 715x-118，r2=0.996 8（n=7），基質效應ME%=（9 930-8 715）/8 715×100%=13.94%;代謝物CCIM在純溶劑中的曲線方程為y=34 302x-15，r2=0.996 4; 在馬鈴薯基質中的曲線方程為y=30 036x-216，r2=0.998 6;CCIM基質效應ME%=（34 302-30 036）/30 036×100%=14.20%。上述結果表明，3種農藥在線性范圍內，響應值與其質量濃度之間線性關系良好，且未見明顯的基質效應。本研究采用基質配制工作溶液。

2.3 添加回收率及重復性

本試驗設置3個添加水平，每個添加水平作3組平行試驗，相應的回收率及相對標準偏差（relative standard deviation，簡稱RSD）結果如表3所示。由表3可知，3種農藥平均回收率在76.4%～95.9%之間，相對標準偏差在0.91%～5.62%之間。

2.4 方法的定量限

以最小添加濃度作為方法的定量限、唑菌酮在馬鈴薯中的LOQ為0.02 mg/kg;氰霜唑、CCIM在馬鈴薯中的LOQ為0.01 mg/kg。本試驗所測溶劑空白、馬鈴薯空白樣品在目標物出峰區間的信號均小于LOQ水平響應的30%。

3 結論

本研究開發的方法，線性相關性、準確度、精密度、專屬性LOQ的檢測結果均達到指標。該方法簡捷、高效，具有較高的靈敏度和良好的精密度等特點，能滿足國內外相關農藥最大殘留量的標準要求，適合推廣。

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