黑斑蛙腐皮病病原分離、鑒定及致病性研究

李成偉 王均 蘇航 耿毅

摘要：為了解黑斑蛙養殖場大規模暴發腐皮病的病原，從患病蛙肝臟中分離獲得1株革蘭氏陰性桿菌（編號：QW），對其培養特性、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因檢測、致病性及藥物敏感性進行分析。結果表明，菌株QW表型特征和理化特性與洛菲不動桿菌相似，16S rRNA和gyrB基因在系統發育樹上與洛菲不動桿菌聚集為一族，最終判定該菌為洛菲不動桿菌，是黑斑蛙上的一種新病原;致病性研究表明，該菌能夠通過浸泡的方式感染黑斑蛙，具有較強的致病性，發病癥狀主要表現為皮膚潰爛和內臟器官出血，與自然發病癥狀一致;藥敏試驗表明，洛菲不動桿菌僅對四環素、氧氟沙星和氟苯尼考3種抗生素敏感。本研究鑒定出引起黑斑蛙腐皮病的病原為洛菲不動桿菌，并對其致病性進行研究，同時檢測了其藥物敏感范圍，為該病臨床防治用藥提供理論依據。

關鍵詞：黑斑蛙;洛菲不動桿菌;分離鑒定;致病性;藥物敏感

中圖分類號：S947.2 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0174-05

黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）屬無尾目蛙科側褶蛙屬，在我國華北、華中、華南地區的平原和丘陵分布較廣泛，也是我國近年來養殖蛙類中的主要品種之一。由于該品種是近年來擴大的養殖規模[1]，相對于其他傳統養殖蛙類如牛蛙、虎紋蛙、美國青蛙的規模化養殖歷程較短，疾病研究相對較少，發病后只能參考其他蛙類疾病進行比較處理，但水生動物不同種屬間具有同病不同癥、同癥不同病的特征。如牛蛙、虎紋蛙上常見的白內障、歪脖子疾病，這此疾病已報道的病原有氣單胞菌、腦膜敗血伊麗莎白菌、淺黃假單胞菌等[2-3]，而在黑斑蛙上的相同癥狀，病原卻出現了肺炎克雷伯菌[4]。因此，應對不同品種、病原進一步區分研究。對于蛙類的腐皮癥，已報道的有牛蛙和棘胸蛙由奇異變形桿菌感染引起[5-6]，但黑斑蛙的腐皮病未見相關報道。2019年6月，四川省內江市某黑斑蛙養殖場出現黑斑蛙大面積死亡，主要表現為頭部、背部及四肢出現不同程度的腐爛，剖解可見肝臟腫大、腎臟及肺部出血。本研究對其病原進行分離，并通過病原菌的形態特征、生理生化特性及16S rRNA和gyrB基因測序與系統發育分析進行鑒定，確定該病原菌的種屬地位;然后通過人工感染試驗確定該病原菌的致病性;最后通過藥物敏感試驗分析該病原菌的藥物敏感范圍，旨在為該病的臨床防治用藥提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

四川省內江市某黑斑蛙養殖場的發病黑斑蛙（25～50 g）頭部、背部及四肢出現不同程度腐爛，剖解可見肝臟腫大出血、腎臟及肺部出血。采集患病典型的黑斑蛙進行實驗室細菌接種;健康黑斑蛙采集于另一黑斑蛙養殖場，實驗室暫養15 d確定健康無病后用于人工感染試驗。

1.2 主要試劑

牛腦心浸液培養基（BHI，美國BD公司），細菌生化微量鑒定管（杭州天和微生物試劑有限公司），PCR所用試劑、特異性引物及細菌基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），藥敏試驗紙片（杭州微生物試劑有限公司）。

1.3 病原菌的分離

無菌操作接種患病黑斑蛙的肝、脾、腎臟組織劃線于BHI培養基上，于28 ℃生化培養箱中培養24～48 h后挑取顏色、大小、形態特征基本一致的優勢菌落進一步培養。純化后再轉接至斜面培養基上，4 ℃保存備用。

1.4 分離菌株形態學與生理生化鑒定

將純化后的細菌接種至BHI瓊脂平板，于生化培養箱中28 ℃培養24 h，觀察菌落形態大小，同時對菌體進行革蘭氏染色，光學顯微鏡觀察菌體形態特征。挑取單個菌落接種于微量生化管中，28 ℃下培養24～48 h，參考《常見細菌系統鑒定手冊》[7]和《伯杰細菌鑒定手冊》[8]進行生理生化特性鑒定。

1.5 16S rRNA和gyrB基因擴增及序列測定

按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA作為PCR模板。采用細菌通用引物進行PCR擴增。PCR反應條件為94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

將分離菌株的16S rRNA基因序列和gyrB基因擴增序列與GenBank中已知核酸序列進行Blast分析，調出與該序列相關性較高的核酸序列，用MEGA 6.0軟件包中的Neighbor-Joining法構建系統進化樹，重復抽樣1 000次分析系統樹各分枝的置信度。

1.6 人工感染試驗

將復壯后的菌株接種到BHI肉湯培養基中，在28 ℃，120 r/min的搖床中培養24 h后，革蘭氏染色檢驗純度。采用生理鹽水調整細菌濃度至3.0×108、3.0×107、3.0×106 CFU/mL，將1 L菌液加入黑斑蛙養殖桶中浸泡，對照組加入等量的生理鹽水，每組20只黑斑蛙。連續觀察14 d，記錄黑斑蛙發病情況和死亡情況，并分離病原進行鑒定。

1.7 藥物敏感試驗

采用藥敏紙片法對分離菌株進行藥敏試驗，采用氨芐西林、青霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、阿齊霉素、克拉霉素、四環素、多西環素、制霉菌素、恩諾沙星、丁胺卡那、諾氟沙星、氧氟沙星、多粘菌素B、氟苯尼考17種藥物進行藥敏試驗。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離及生理生化特性

從患病黑斑蛙的肝臟分離得到1株高純度的優勢菌株（編號：QW），其菌落狀態是灰白色、表面光滑、圓形凸起、邊緣整齊、透明、涂片染色鏡檢可見革蘭氏陰性短桿菌（圖1），生化反應結果見表1。

2.2 分離菌株的鑒定

以分離菌株QW的DNA為模板，采用細菌16S rRNA和gyrB基因通用引物進行PCR擴增，經電泳檢測和凝膠成像系統后，16S rRNA基因于1 500 bp 左右得到目的條帶（圖2-a），gyrB基因于 1 200 bp 左右得到目的條帶（圖2-b）。經測序得到16S rRNA序列1 409 bp（genbank登陸號：MN396229），gyrB基因1 113 bp（genbank登陸號：MN504787）。

系統發育樹結果顯示，在16S rRNA序列、gyrB基因序列上，菌株QW上都分別聚在洛菲不動桿菌（Acinetobacter lwoffii）的分支上（圖3、圖4）。結合生理生化結果，將菌株QW判定為洛菲不動桿菌。

2.3 人工感染試驗

人工浸泡感染連續觀察14 d，試驗結果見表2，隨著浸泡菌液濃度的增大，黑斑蛙的死亡率隨之升高，同時病癥周期加快，表現出背部、腿部表皮潰爛（圖5-a），肝臟腫大，腎臟、肺部出血（圖 5-b），與自然發病癥狀相似，推測洛菲不動桿菌是該病的主要病原，且對黑斑蛙致病性較強。

2.4 藥敏試驗

采用紙片擴散法，對菌株QW進行17種藥物敏感性試驗。由表3可知，QW菌株僅對四環素、氧氟沙星、氟苯尼考3種抗生素敏感;而對慶大霉素、鏈霉素、阿齊霉素、丁胺卡那4種抗生素介于敏感與耐藥之間;其余的10種均為耐藥。

3 討論

洛菲不動桿菌是一種可利用環境中多種營養物質作為自身能量來源的需氧型革蘭氏陰性菌，因其適應性強，普遍存在于土壤、水及干燥環境中，且是一種對多種抗生素具有抗性的細菌，一直以來是醫院感染常見的一種條件性致病菌[9]。洛菲不動桿菌感染包括菌血癥、繼發性腦膜炎、尿路感染、手術部位感染、胃炎和肺炎，特別是在重癥監護室中[10]。在養殖業中，洛菲不動桿菌能廣泛引起養殖動物感染，感染包括奶牛子宮內膜炎[11]、仔豬肺部感染[12]、禽類呼吸道感染[13]等，水生動物感染相對較少，感染鯉魚[14]、虹鱒[15]、草魚[16]，主要表現為敗血癥、胡子鲇“吊頭病”[17]等， 兩棲動物感染的美國青蛙“抽搐癥”[18]、牛蛙腹水病[19]。本試驗表明，洛菲不動桿菌感染黑斑蛙后，主要表現為腐皮和肝臟腫大出血、腎臟出血、肺出血，這與洛菲不動桿菌感染牛蛙癥狀相似[19]，感染后黑斑蛙表皮輕微腐爛、肝臟腫大充血，但未出現美國青蛙和牛蛙的腹水、肝臟白色結節、腿部充出血斑，證明不同環境、不同種屬動物感染間存在一定差異。

水產動物中細菌性疾病的治療最常用且有效的方法為內服抗生素，而抗生素的準確使用需要以藥敏試驗結果作為依據[20]。相關研究表明，在人醫領域洛菲不動桿菌不同地域分離株的耐藥性不同，但大部分菌株對青霉素、頭孢類、復方新諾明表現出強耐藥性，對阿米卡星、亞胺硫霉素、美羅培南敏感[21]，但除阿米卡星不能獸用且存在多重耐藥、耐藥率上升較快外，洛菲不動桿菌已成為“超級耐藥菌的潛在菌群”[22]。近幾年，在水生動物上分離的洛菲不動桿菌對廣譜β-內酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等存在多重耐藥性[15]。本研究分析了洛菲不動桿菌對17種抗生素的敏感性，結果顯示，菌株僅對四環素、氧氟沙星、氟苯尼考3種藥物敏感，對慶大霉素、鏈霉素、阿齊霉素、丁胺卡那4種抗生素介于敏感與耐藥之間，其余的10種均為耐藥，說明洛菲不動桿菌具有較強的耐藥性，因此建議臨床治療不能盲目使用抗生素。首先通過改善養殖環境，提高動物自身免疫力，調節水環境菌群結構等措施來預防該疾病，發病后需要科學診斷，在藥物敏感試驗指導下科學用藥。

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